CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS XILANASAS BACTERIANAS.

INGENIERÍA DE ENZIMAS CON LA XILANASA B DE

PAENIBACILLUS BARCINONENSIS

Tesis Doctoral
Óscar Gallardo Román
Barcelona, 2007
 UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE BIOLOGIA
DEPARTAMENT DE MICROBIOLOGIA

CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS XILANASAS BACTERIANAS.

INGENIERÍA DE ENZIMAS CON LA XILANASA B DE
PAENIBACILLUS BARCINONENSIS

Memoria presentada por Óscar Gallardo Román para optar al grado de Doctor por la
Universitat de Barcelona

Programa de doctorado: Microbiologia Ambiental i Biotecnologia (1999 – 2001)

Tesis realizada bajo la dirección del Dr. Francisco I. Javier Pastor Blasco, en el
Departamento de Microbiología de la Universitat de Barcelona.

VºBº del Director de Tesis Memoria presentada por

Dr. Francisco I. Javier Pastor Blasco Óscar Gallardo Román

Barcelona, Octubre del 2007

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero dar mi más sincero Mil gracias también a toda la gente del LoKal
agradecimiento al Dr. Francisco I. Javier por su cariño, su amistad y su comprensión
Pastor, por haber dirigido este trabajo de tesis. durante tantos años, y en especial a Xavier
Sin su guía, su apoyo y su comprensión en los Cuartiella, alma pater del LoKal.
momentos difíciles este trabajo no habría sido
posible. Y como no, darles las gracias a mis padres,
Antonio y Pilar, a mi hermana, Mª Eugenia, y
Quiero darles las gracias también al resto de a toda mi familia por haberme apoyado
los compañeros que han pasado por el grupo incondicionalmente desde el día en que nací.
de investigación a lo largo de estos años, por
su ayuda, su apoyo y su amistad, a la Dra.
Pilar Díaz, a Marga, Marta, Núria P., Pere,
Cristina, Iulia, Serena, Arnau, Noelia, Nikolia,
Eric, y en especial a Cristian, que lleva
soportándome desde que nos conocimos en el
instituto.

Mi agradecimiento también al Dr. Julio

Polaina, y a los integrantes de su grupo de
investigación durante mi estancia en València,
Txiqui, Maela, Ana-Cris y Lorena.

También quiero agradecerles su amistad y los

buenos momentos compartidos dento y fuera
del departamento a Xavi Bonjoch, Quim,
Marc, Javi del Campo, Núria F., Laura y
Sonia.

También dar las gracias a Natalia, Sandra,

Rocío, Markus, Pili, Silvia, Nestor, Ayalke,
Rosa, Tony, Cristina Garcia, Xavi Vilanova,
Salva, Núria J., Damir, Unai, Lluis, y al resto
de compañeros del Departamento de
Microbiología, por compartir tantas horas de
trabajo y tantas cenas.
ABREVIATURAS
Abreviatura Definición
Å ångström
ADN ácido desoxiribonucleico
Amp ampicilina
AOX adsorbable organic halogens
ARN ácido ribonucleico
Bl % ISO porcentaje de blancura ISO
bp pares de bases
BSA seroalbúmina bovina
C- control negativo
C+ control positivo
CBD cellulose binding domain (dominio de unión a celulosa)
CBM carbohydrate binding module (módulo de unión a carbohidratos)
Cm cloramfenicol
CMC carboximetil celulosa
Da dalton
ECF elemental chlorine free
et al. y otros / y colaboradores
FDA food and drug administration
FPLC fast protein liquid chromatography
g gramo
GRAS generally recognized as safe
h hora
HexA ácidos hexenurónicos
ICDH isocitrato deshidrogenasa
Ik índice kappa
IPTG isopropil-β-tiogalactopiranósido
ISO international organization for standardization
kb kilobases
kDa kilodalton
Km kanamicina
kPa kilopascal
l litro
M molar (mol/l)
MDH malato deshidrogenasa
mg miligramo
min minuto
ml mililitro
Abreviatura Definición
mM milimolar
MP motivo Pir
MPa megapascales
ng nanogramo
nm nanómetro
o orto
oNPX oNitrofenil-β-D-Xilopiranósido
p para
PEG polietilenglicol
pg picogramo
pI punto isoeléctrico
pNAf pNitrofenil-α-L-Arabinofuranósido
pNAp pNitrofenil-α-L-Arabinopiranósido
pNPG pNitrofenil-β-D-Glucopiranósido
pNPG2 pNitrofenil-β-Celobiósido
pNPG3 pNitrofenil-β-Celotriósido
pNPG4 pNitrofenil-β-Celotetraósido
pNPG5 pNitrofenil-β-Celopentaósido
pNPX pNitrofenil-β-D-Xilopiranósido
psi pound per square inch (libra por pulgada cuadrada)
r.p.m. revoluciones por minuto
RBB Remazol Brilliant Blue
SDS PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
sp. especie
ssp. subespecie
TCF total chlorine free
U unidad de actividad
V voltios
W vatios
X gal 5 bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
XBD xylan binding domains (dominios de unión a xilano)
µg microgramo
µl microlitro
µm micrómetro / micra
µM micromolar
μmol micromol
I
ÍNDICE
 I

Introducción 1
1. Introducción...................................................................................... .......................3
1.1. La pared celular vegetal.........................................................................................3
1.1.1. Estructura y composición................................................................... ......................3
1.1.2. Celulosa.............................................................................................................. ......5
1.1.3. Hemicelulosas................................................................................... .......................5
1.1.4. Pectinas............................................................................................ ........................7
1.1.5. Lignina................................................................................................ .....................8
1.2. El xilano.................................................................................................................9
1.3. Enzimas degradadoras de xilano..........................................................................11
1.3.1. β-xilosidasas............................................................................................... ............12
1.3.2. α-L-arabinofuranosidasas.................................................................. .....................13
1.3.3. α-D-glucuronidasas...................................................................... ..........................13
1.3.4. Esterasas....................................................................................................... ..........13
1.4. Xilanasas..............................................................................................................14
1.4.1. Características generales........................................................................................ .14
1.4.2. Clasificación de las xilanasas.......................................................... .......................16
1.4.3. Mecanismo catalítico...................................................................................... ........18
1.4.4. Estructura....................................................................................... ........................20
1.4.5. Aplicaciones de las xilanasas................................................................................. .26
2 - Objetivos e interés del trabajo realizado............................................................ .31
2.1. Clonación e identificación de xilanasas de Bacillus sp. BP-7.............................31
2.2. Caracterización de la xilanasa B (XynB) de Paenibacillus barcinonensis y
sobreexpresión en huéspedes homólogos...................................................................31
2.3. Estudio estructural e ingeniería de proteínas con XynB de Paenibacillus
barcinonensis..............................................................................................................32

Materiales y Métodos 33
1. Microorganismos utilizados........................................................................ ..........35
2. Cultivo y mantenimiento de microorganismos............................................... .....35
2.1. Medios de cultivo.................................................................................................35
2.2. Mantenimiento de cepas......................................................................................38
2.3. Fraccionamiento celular.......................................................................................38
2.3.1. Sonicación............................................................................................... ...............38
2.3.2. French Press................................................................................ ..........................38
2.3.3. Lisis celular seguida de ultracentrifugación......................................................... ...39
3. Ensayos de actividad enzimática......................................................................... .39
3.1. Determinación de actividad hidrolítica sobre polisacáridos mediante el método
de Nelson-Somogyi.....................................................................................................39
3.2. Ensayo cromogénico de actividad xilanasa.........................................................41
3.3. Ensayo de actividad sobre aril derivados.............................................................42
3.4. Determinación del pH óptimo..............................................................................43
3.5. Determinación de la temperatura óptima.............................................................43
II

3.6. Cuantificación de la actividad malato deshidrogenasa........................................43

3.7. Cuantificación de la actividad isocitrato deshidrogenasa....................................44
4. Vectores plasmídicos utilizados.............................................................. .............45
5. Análisis y manipulación del ADN recombinante........................ .........................46
5.1. Extracción de ADN plasmídico...........................................................................46
5.1.1. Minipreparación de ADN plasmídico por lisis alcalina........................ ..................46
5.1.2. Midipreparación de ADN plasmídico.......................................................... ...........46
5.2. Digestión con enzimas de restricción y tratamiento con RNAsa.........................47
5.2.1. Digestión con enzimas de restricción........................................... ..........................47
5.2.1. Tratamiento con RNAsa......................................................................... ................47
5.3. Ligación de moléculas de ADN...........................................................................47
5.4. Amplificación por PCR........................................................................................47
5.4.1. Amplificación de alta fidelidad.................................................. ............................47
5.4.2. PCR mutagénica........................................................................................ .............48
5.5. Gene Shuffling (recombinación in vitro por PCR)...............................................48
5.6. Transformación....................................................................................................51
5.6.1. Transformación de Escherichia coli....................................................... ................51
5.6.2. Transformación de Bacillus subtilis........................................................................ 51
6. Secuenciación y análisis de secuencia........................................................... .....53
6.1. Secuenciación......................................................................................................53
6.2. Análisis informático de secuencias......................................................................53
7. Dicroismo circular............................................................................................... ...54
8. Análisis electroforético.......................................................................................... 54
8.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes................................54
8.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas.......................55
8.3. Tinción de proteínas con azul de Coomassie.......................................................56
8.4. Revelado zimográfico (zimograma)....................................................................56
8.5. Isoelectroenfoque.................................................................................................57
8.6. Electroforesis y transferencia de proteínas para su secuenciación N-terminal....57
8.7. Electroforesis en geles de agarosa.......................................................................58
9. Purificación de proteínas........................................................... ...........................59
9.1. Preparación de las muestras.................................................................................59
9.2. Cromatografía en columna...................................................................................60
9.2.1. Cromatografía de gel filtración......................................................................... ......60
9.2.2. Cromatografía de intercambio iónico.............................................. .......................61
9.2.3. Tercer paso opcional de cromatografía.......................................................... .........61
9.3. Concentración de proteínas por ultrafiltración....................................................62

Capítulo I. La xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7 63

1. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............65
2. - Resultados............................................................................. ..............................65
2.1. Clonación e identificación de xilanasas de Bacillus sp. BP-7.............................65
2.1.1. Construcción y escrutinio de la genoteca de Bacillus sp. BP-7............................. ..65
 III

2.1.2. Análisis de los clones con actividad xilanasa............................... ..........................67

2.1.2.1. - Análisis de los plásmidos recombinantes.............................................................67
2.1.2.2. - Subclonaje del inserto de pXA3............................................................................67
2.1.3. Secuenciación e identificación del gen xynA.................................. .......................68
2.2. Caracterización bioquímica de la xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7..............70
2.2.1. Determinación del peso molecular y del punto isoeléctrico.............................. ......70
2.2.2. Propiedades enzimáticas.................................................................................. .......71
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato.......................................................................................71
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima.........................................................................72
2.2.2.3. - Termorresistencia..................................................................................................73
2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre la actividad..................................................73
2.3. Expresión de la xilanasa XynA en levadura........................................................74
2.3.1. Antecedentes................................................................................... .......................74
2.3.2. Análisis de actividad de los clones recombinantes......................... ........................76
2.3.3. - Localización celular........................................................................ .....................77

Capítulo II. Las xilanasas YnfF y XynD de Bacillus sp. BP-7 79

1. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............81
2. - Resultados............................................................................. ..............................81
2.1. Aislamiento de las xilanasas del clon Escherichia coli/pXA5............................81
2.1.1. Subclonaje del inserto del plásmido pXA5.................................................... .........81
2.1.2. Secuenciación e identificación de los genes de pXA5............................. ...............82
2.1.2.1.- Secuencia y homología de xynD de Bacillus sp. BP-7..........................................83
2.1.2.1.- Secuencia y homología de ynfF de Bacillus sp. BP-7...........................................83
2.1.2. Aislamiento de los genes xynD e ynfF de Bacillus sp. BP-7..................................87
2.2. Caracterización bioquímica de la enzima YnfF de Bacillus sp. BP-7.................88
2.2.1. Determinación del peso molecular.......................................................................... 88
2.2.2. Propiedades enzimáticas.................................................................................. .......89
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato.......................................................................................89
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima........................................................................89
2.2.2.3. - Termorresistencia..................................................................................................90
2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre la actividad..................................................91

Capítulo III. Estudio de la xilanasa XynB de Paenibacillus

barcinonensis 93
1. - Introducción y Objetivos...................................................................... ...............95
2. - Resultados............................................................................. ..............................95
2.1. Especificidad de sustrato de XynB de Paenibacillus barcinonensis...................95
2.2. Producción de XynB de Paenibacillus barcinonensis en huéspedes homólogos96
2.2.1. Clonación en vectores lanzadera E. coli-Bacillus subtilis.....................................96
2.2.1.1. - Amplificación de xynB para su clonación en Escherichia coli............................96
2.2.1.2. - Transformación en las cepas de Bacillus subtilis MB216 y MW15.....................98
2.2.2. Expresión en Bacillus subtilis............................................................................ .....99
IV

2.2.2.1. - Análisis de expresión de la xilanasa en las cepas recombinantes de Bacillus

subtilis...................................................................................................................................99
2.2.2.2. - Expresión en diferentes medios de cultivo.........................................................100
2.3. Localización celular de XynB............................................................................101
2.3.1. Localización de XynB en Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.......................101
2.3.2. Localización de XynB en Paenibacillus barcinonensis.............................. ..........102
2.3.3. Análisis de péptido señal................................................................... ..................106
2.4. Estudio de las homologías de XynB..................................................................108
2.4.1. Homologías de XynB...................................................................... .....................108

Capítulo IV. Ingeniería de Proteínas con la xilanasa XynB de

Paenibacillus barcinonensis 111
1. - Introducción y Objetivos................................................................... ................113
2. - Resultados.......................................................................... ...............................113
2.1. Análisis estructural y funcional de XynB de Paenibacillus barcinonensis ......113
2.1.1 Análisis de la estructura primaria.................................................. ........................113
2.1.2. Predicción de estructura secundaria y terciaria........................................ .............114
2.1.3. Mutagénesis dirigida................................................................. ...........................116
2.2. Purificación y cristalización de XynB...............................................................117
2.2.1. Obtención de clones sobreproductores de XynB.......................... ........................117
2.2.2. Resultados de cristalografía........................................................................ ..........119
2.3. Aumento de la termorresistencia de XynB de Paenibacillus barcinonensis.....121
2.3.1 Mutagénesis aleatoria.......................................................................... ..................121
2.3.2 Selección de mutantes termorresistentes............................................................... .122
2.3.3 Secuenciación de los mutantes seleccionados y aislamiento de las mutaciones.....125
2.3.4 Purificación de las xilanasas mutantes............................................................. ......127
2.3.5 Termoestabilidad de las xilanasas mutantes................................ ..........................128
2.3.6 Obtención de dobles mutantes................................................................ ...............129
2.3.7 Purificación y ensayos de termoestabilidad de las xilanasas dobles mutantes.......131
2.3.8 Efectos de las mutaciones sobre la estructura de XynB............................ .............132
2.3.9 Estudio de las constantes cinéticas de XynB y de las xilanasas mutantes..............133

Anexo I. Aplicación de las xilanasas estudiadas en el Blanqueo

de la Pasta de Papel 135
1. - Introducción y Objetivos................................................................... ................137
2. - Resultados y Discusión.................................................................................. ...137
2.1. Producción en fermentador de las xilanasas a evaluar.......................................137
2.2. Determinaciones de actividad enzimática..........................................................138
2.3. Ensayos papeleros..............................................................................................138
2.3.1. Características de las pastas papeleras..................................................... .............138
2.3.2. Secuencia de blanqueo XDP............................................................................ .....139
2.3.3. Secuencia de blanqueo XDEOPD1................................................................... ....140
 V

Discusión 143
1. Xilanasas de Bacillus sp. BP-7............................................................................ 145
1.1.- Identificación y caracterización de XynA........................................................145
1.2.- Identificación y caracterización de YnfF..........................................................146
1.3.- Identificación de XynD....................................................................................148
1.4.- Sistema xilanolítico de Bacillus sp. BP-7.........................................................149
1.5.- Expresión de xilanasas en levaduras................................................................150
2. XynB de Paenibacillus barcinonensis ................................................... ............152
2.1. Expresión en huéspedes homólogos..................................................................152
2.2. Localización celular...........................................................................................154
2.3. Relación estructura-función...............................................................................158
2.4. Termoestabilidad................................................................................................161
3. Aplicación de las xilanasas estudiadas en el blanqueo de la pasta de papel.165

Conclusiones 167

Bibliografía 171
A........................................................................................................... .....................173
B........................................................................................................... .....................173
C........................................................................................................... .....................176
D........................................................................................................... .....................177
E..................................................................................................... ...........................178
F............................................................................................................................... ..178
G................................................................................................................. ...............179
H........................................................................................................... .....................180
I.......................................................................................................................... ........181
J......................................................................................................................... ........181
K........................................................................................................... .....................182
L............................................................................................................................... ..183
M....................................................................................................................... .........184
N........................................................................................................... .....................185
O................................................................................................................. ...............186
P..................................................................................................... ...........................186
Q................................................................................................................. ...............188
R........................................................................................................... .....................188
S..................................................................................................... ...........................188
T............................................................................................................................... ..191
U........................................................................................................... .....................192
V..................................................................................................... ...........................192
W................................................................................................... ............................193
Y..................................................................................................... ...........................193
Z............................................................................................................................... ..194
VI

Publicaciones 195
INTRODUCCIÓN
2 µm
 3

excesiva expansión de la célula debida a la

1. INTRODUCCIÓN entrada y circulación de agua, actúa de barrera
El trabajo de la presente tesis doctoral se frente a patógenos y es el compartimento
centra en el estudio de xilanasas microbianas. celular que media todas las relaciones de la
Como enzimas que son, las xilanasas son célula vegetal con el entorno.
biocatalizadores (incrementan la velocidad de
las reacciones químicas al reducir la energía de
1.1.1. Estructura y composición
activación necesaria para la transformación de
La pared celular vegetal es una red compleja
sustratos en productos), que catalizan la
altamente organizada, formada por
degradación del xilano, polisacárido abundante
microfibrillas de celulosa unidas entre sí por
en la pared celular vegetal.
hemicelulosas, embebidas en una matriz
Debido a esta propiedad y al uso frecuente de
gelatinosa de sustancias pécticas, y reforzada
materiales de origen vegetal en la industria, las
por glicoproteínas estructurales y, en
xilanasas presentan, además de su interés
ocasiones, por compuestos aromáticos como la
científico, un gran interés a nivel
lignina.
biotecnológico. En este sentido, la aplicación
industrial de xilanasas, al igual que la de
La pared celular vegetal se estructura en tres
muchas otras enzimas (como proteasas,
partes fundamentales (Figura IN.1.1):
amilasas y celulasas), presenta claras ventajas
– Lámina media: es la primera capa que se
respecto a los procesos industriales
deposita durante la división celular vegetal,
convencionales, como pueden ser la elevada
y una vez completada ésta queda
eficiencia, su bajo impacto medioambiental y
localizada entre las paredes primarias de
su rentabilidad económica (Ahuja et al., 2004;
las células resultantes. Está formada
Schäfer et al., 2007).
principalmente por sustancias pécticas, que
cementan las paredes primarias de células
1.1. La pared celular vegetal adyacentes manteniendo la unión entre

La pared celular de las células vegetales se éstas (Zarra y Revilla, 1993; Heredia et al.,

localiza en la zona exterior de la célula, en 1995).

contacto íntimo con la membrana plasmática. – Pared primaria: está presente en todas las

Proporciona rigidez, soporte estructural y células vegetales y es producto de la

mecánico a las células, determinando la acumulación de microfibrillas de celulosa,

morfología y el crecimiento celular, y por orientadas en diversas direcciones,

tanto, en última instancia, la arquitectura de la formando una red relativamente laxa que

planta. Además, la pared celular previene la permite el crecimiento celular.

4

Esta compuesta por celulosa, – Pared secundaria: cuando existe, es la capa

hemicelulosas, pectina y en menor medida
por glicoproteínas estructurales (como
extensinas y lectinas) unidas entre ellas o
con los polisacáridos mediante enlaces
covalentes, y otras proteínas solubles
(como enzimas y proteínas
transportadoras). La pared primaria
continua creciendo en área y espesor
mientras las células crecen en tamaño
(Goodwin y Mercer, 1983; Smith, 1993).
más adyacente a la membrana plasmática.
Se forma en algunos tipos celulares
vegetales una vez se ha detenido el
crecimiento celular, y generalmente está
formada por 3 subcapas: S1 (la más
externa), S2 y S3 (la más interna).
A diferencia de la pared primaria, contiene
una mayor proporción de celulosa, una
baja cantidad de hemicelulosas y, en
algunos tipos celulares (como las fibras de
xilema y las traqueidas), lignina y/o ceras

Lámina media
Pared secundaria

Pared primaria
1 μm

Pectina

Lámina media

Pared primaria

Membrana plasmática
Hemicelulosas

Proteína fibrilar

Microfibrilla de celulosa

Proteína soluble

Figura IN.1.1: Esquema de la pared celular de una célula vegetal en crecimiento, e imagen de microscopía
electrónica de transmisión de la pared celular en células de tejidos rígidos.

(suberina y cutina). Resulta así una
estructura más gruesa y compacta que la
pared primaria, proporcionando una mayor
rigidez y resistencia (Heredia et al., 1995;
Smith, 1993).
Los principales polímeros que componen la
pared celular vegetal son pues la celulosa, la
pectina, las hemicelulosas y la lignina, que en
conjunto constituyen la denominada
lignocelulosa (Thomson, 1993; Heredia et al.,
1995; Wong et al., 1998).
La constitución molecular y estructural precisa
de la pared celular depende del tipo de célula,
tejido y especie vegetal, siendo más variable la
composición de la pared celular secundaria
(que en algunos tipos celulares es inexistente)
que la de la pared celular primaria. De esta
manera, a pesar de las variaciones, una pared
celular primaria típica en las dicotiledóneas
estaría formada por un 25 - 30% de celulosa,
un 20 - 35% de hemicelulosa, un 35% de
pectina y un 5 - 10% de proteínas, en base al
peso seco (Kolek y Kozinka, 1992; Fry, 2001).
1.1.2. Celulosa
La celulosa es el componente más abundante
de la biomasa vegetal, y se considera el
biopolímero más abundante de la Tierra
(Saxena y Brown, 2005). Se encuentra
formando parte de la denominada fase
microfibrilar de la pared vegetal (altamente
cristalina), la cual, además de celulosa, puede
5
contener microfibrillas de mananos o de
xilanos β(1→3).
Es un homopolímero lineal no ramificado
formado por moléculas de β-D-glucosa unidas
entre sí por enlaces glucosídicos β(1→4), en el
que cada residuo de D-glucosa presenta una
rotación de 180º respecto al residuo anterior,
por lo que la unidad estructural básica
repetitiva de la celulosa es la celobiosa
(formada por 2 residuos de D-glucosa) y no la
D-glucosa (Delmer y Amor, 1995).
Las cadenas de celulosa se encuentran
asociadas entre sí intra e intermolecularmente
mediante puentes de hidrógeno y fuerzas de
van der Waals, dando lugar a una estructura
fibrilar rígida, insoluble y cristalina
denominada microfibrilla (Figura IN.1.2).
Cada microfibrilla de celulosa está formada
por unas 36 cadenas de celulosa, y su diámetro
es de unos 3 nm (Lerouxel et al., 2006).
1.1.3. Hemicelulosas
Las hemicelulosas son polisacáridos
heterogéneos, neutros, que presentan una
cadena principal con ramificaciones cortas.
Suponen habitualmente el 20 - 35% del peso
seco de la pared celular vegetal (De Vries y
Visser, 2001), donde, juntamente con la
pectina, la lignina y las proteínas, constituyen
la denominada matriz amorfa de la pared
celular, dentro de la cual se encuentra
embebida la fase microfibrilar cristalina.
6

Cadena de celulosa

β-D-Gluc osa Celobiosa

200 nm
Microfibrilla

Cadenas de celulosa
unidas por puentes
de hidrógeno

Figura IN.1.2: Micrografía electrónica de microfibrillas de celulosa de la pared primaria de células

epiteliales de guisante (Somerville et al., 2004), y esquema de la organización de la celulosa.

Las hemicelulosas se caracterizan por requerir 4 - 24%). Se encuentran formando uniones

para su extracción de la pared soluciones entre sí, con otros polisacáridos, como las
alcalinas (como NaOH al 17,5% o KOH al microfibrillas de celulosa y las pectinas, y con

Tabla IN.1.1: Hemicelulosas.

Xilano Cadenas de xilosa β(1→4) con cadenas laterales

cortas de otros azúcares unidas a la cadena principal
mediante el C2 y el C3 de las xilosas.
Manano puro Polímero no ramificado de manosa β(1→4). Muy
compacto debido a la presencia de numerosos
puentes de hidrógeno intramoleculares.
Glucomanano Cadenas de manosa β(1→4) que contienen residuos
de glucosa. La relación manosa:glucosa es de 3:1.
Mananos

Galactomanano Cadenas de manosa β(1→4) con cadenas laterales

de residuos de galactosa simples unidos por enlaces
α(1→6) a los residuos de manosa de la cadena
principal.
Galactoglucomanano Como el glucomanano, pero con cadenas laterales
de residuos de galactosa simples unidos por enlaces
α(1→6) a los residuos de glucosa o manosa de la
cadena principal.
Xiloglucano Cadenas de glucosa β(1→4) con cadenas laterales
cortas de xilosa unidas por enlaces α(1→6) a los
residuos de glucosa de la cadena principal.
Calosa Polímero no ramificado de glucosa β(1→3).
 7

la lignina, mediante enlaces tanto covalentes 1.1.4. Pectinas

como no covalentes. Las pectinas o polisacáridos pécticos son una
La hemicelulosa más abundante en los cereales mezcla compleja de heteropolímeros ácidos y
y las maderas duras (angiospermas) es el neutros, que se caracterizan por su capacidad
xilano, mientras que en las maderas blandas para formar geles. Forman parte de la matriz
(gimnospermas) es el galactoglucomanano. amorfa de la pared celular, actuando como
Otras hemicelulosas frecuentes en vegetales lubricantes y cementantes tanto en la pared
son el xiloglucano, el galactomanano, el primaria como en la lámina media (donde se
glucomanano, el manano puro y la calosa encuentran en mayor concentración). A
(Tabla IN.1.1) (De Vries y Visser, 2001). diferencia de las hemicelulosas, pueden
extraerse de la pared celular mediante métodos
relativamente suaves, como pueden ser
tratamientos con agua caliente, con agentes

Tabla IN.1.2: Pectinas.

Galacturonanos Cadenas de ácido galacturónico α(1→4), metiladas

en diferente proporción en el C6 de los grupos
carboxilos.
Ramnogalacturonano I Cadenas de galacturonano interrumpidas por
residuos ocasionales de L-ramnosa unidos mediante
enlaces α(1→2) a los residuos de ácido
galacturónico adyacentes. Al O4 de estos residuos
de ramnosa pueden unirse largas cadenas de
arabinanos o galactanos.
También pueden encontrarse grupos acetilos unidos
al O2 o al O3 de los residuos de ácido galacturónico
de la cadena principal.
Ramnogalacturonano II Cadenas cortas de galacturonano (mínimo de 8
residuos) que presentan 4 cadenas laterales
diferentes que contienen azúcares poco comunes
como la 2-O-metil-L-fucosa, el ácido 3-deoxi-D-
mano-2-octulosónico, el ácido acérico o la D-apiosa.
Puede formar dímeros mediante puentes borato
entre dos enlaces éster.
Galactanos Cadenas de D-galactosa β(1→4), que pueden
presentar residuos de ácido ferúlico unidos al O6 de
algunas galactosas.
Arabinogalactanos Como los galactanos pero con cadenas laterales de
L-arabinosa unidas al C3 de residuos de galactosa
de la cadena principal.
Arabinanos Cadenas de L-arabinosa α(1→5) que pueden
presentar residuos laterales de L-arabinosa unidas
mediante enlaces α(1→3) a la cadena principal, y/o
residuos de ácido ferúlico unidos al O2 de la
arabinosa terminal.
8

quelantes, como el EDTA, o con ácidos a guaiaquil

b c
propanol
diluidos (Zarra y Revilla, 1993). CH2OH CH2OH CH2OH

CH CH CH
Entre las pectinas se encuentran el CH CH CH

galacturonano, el ramnogalacturonano I, el
ramnogalacturonano II, el galactano, el
OCH3 CH3O OCH3
arabinogalactano y el arabinano (Tabla IN.1.2) OH OH OH

(Heredia, 1995; De Vries y Visser, 2001). p-hidroxifenil siringil

propanol propanol

Deshidrogenación y
polimerización
1.1.5. Lignina
La lignina es un polímero heterogéneo
formado por fenilpropanoides (alcoholes
fenólicos) unidos entre sí por enlaces éter
(C-O-C) o C-C. Los fenilpropanoides que
forman la lignina son los alcoholes
p-cumarílico (p-hidroxifenil propanol),
coniferílico (guaiaquil propanol) y sinapílico
(siringil propanol). Su proporción en la lignina
depende del tipo celular y de la especie vegetal
Lignina
(Figura IN.1.3).
La lignina es la sustancia más abundante en la Figura IN.1.3: Precursores de la lignina y lignina.
matriz amorfa de la pared de plantas leñosas,
encontrándose sobre todo en la lámina media y
en la pared secundaria.
Debido a su carácter hidrofóbico desplaza el
agua de las paredes celulares secundarias,
dando lugar a una red hidrofóbica
tridimensional que interacciona con los demás
componentes de la pared y los mantiene
unidos, aumentando de esta manera la rigidez
de la pared y su resistencia frente a la
degradación química y biológica (Martínez et
al., 2005).

1.2. El xilano
El xilano es un polisacárido muy abundante en
la naturaleza; el más abundante después de la
celulosa (Collins et al., 2005). Forma parte de
las hemicelulosas presentes en la matriz
amorfa de la pared celular secundaria de los
tejidos lignificados de las plantas leñosas
(Timell, 1967), aunque también se puede
encontrar en la matriz de paredes primarias de
células en crecimiento y de semillas y bulbos,
donde tiene función de reserva.
Es la principal hemicelulosa de las maderas
duras (angiospermas), representando un
15 - 30% del peso seco de la pared vegetal, y
es menos abundante en el caso de las maderas
blandas (gimnospermas), donde representa un
7 - 12% del peso seco (Wong et al., 1988).
Su función parece ser básicamente estructural,
manteniendo la integridad de la pared celular
junto con otras hemicelulosas, la celulosa, las
pectinas y la lignina. Además, junto con la
lignina, ayuda a proteger las microfibrillas de
celulosa de la biodegradación.
El xilano está formado por un esqueleto de
moléculas de β-D-xilosa unidas entre sí por
enlaces β(1→4), salvo en algas marinas donde
estos enlaces son también β(1→3). Esta
cadena de β-D-xilopiranosas puede tener
diferente grado de polimerización, siendo éste
mayor en el caso de maderas duras (150 - 200
residuos de xilosa) que en el de maderas
blandas (70 - 130 residuos) (Kulkarni et al.,
1999).
9
Normalmente, la cadena de β-D-xilopiranosas
presenta ramificaciones laterales de diferente
naturaleza, ya que, aunque en algunas plantas
terrestres y algas se han encontrado
homoxilanos formados exclusivamente por
xilosa, lo más frecuente es que el xilano se
encuentre en forma de heteropolisacárido (Beg
et al., 2001). El número y la naturaleza de
estas ramificaciones laterales dependen de la
especie vegetal y del tipo de tejido, siendo las
más comunes aquellas formadas por
(Figura IN.1.4):
- α-L-arabinofuranosa: unida al C3 y/o al
C2 (aunque al C2 con menor frecuencia) de
residuos de β-D-xilopiranosa en xilanos de
maderas blandas (13% de la xilosas) y de
plantas herbáceas.
- Ácido α-D-glucurónico y/o ácido 4-O-
metil-α-D-glucurónico: unido al C2 de
β-D-xilopiranosas tanto en xilanos de
maderas duras (10% de las xilosas) como
en los de maderas blandas (20% de las
xilosas) y en los de plantas herbáceas
(Coughlan y Hazlewood, 1993).
- O-acetilos: unidos al C2, C3 o a ambos
carbonos de β-D-xilopiranosas en los
xilanos de maderas duras (70% de xilosas
acetiladas) y de plantas herbáceas, mientras
que los xilanos de maderas blandas no están
acetilados (Timell, 1967; Coughlan y
Hazlewood, 1993). La acetilación del
xilano aumenta su solubilidad en agua
(Biely, 1985).
10

Figura IN.1.4: Esquema de la estructura de una molécula de xilano y sus ramificaciones.

- Ácidos ferúlico y p-cumárico: compuestos - Glucuronoxilanos: son los xilanos de

fenólicos unidos por enlaces éster al C5 de maderas duras, que poseen cadenas laterales
los residuos de arabinosa. de ácido α-D-glucurónico y/o ácido
Además, se ha descrito la presencia de 4-O-metil-α-D-glucurónico, además de
ramnosa y galactosa en xilanos de algunas grupos O-acetilo.
plantas (Wong et al., 1988). - Glucuronoarabinoxilanos: los xilanos de
maderas blandas; denominados así por
En función de las ramificaciones laterales
presentar cadenas laterales de
podemos clasificar los xilanos en 4 familias
α-L-arabinofuranosa, ácido
principales (Joseleau et al., 1992):
α-D-glucurónico y/o ácido
- Arabinoxilanos: se denominan así los
4-O-metil-α-D-glucurónico y ácidos
xilanos de plantas herbáceas, debido a la
ferúlico y cumárico.
gran cantidad de residuos laterales de
- Homoxilanos lineales: no presentan
α-L-arabinofuranosa. Además presentan
ramificaciones en las cadenas de
grupos laterales acetilo, de ácido
β-D-xilopiranosa. Sólo se han encontrado
glucurónico y de ácido ferúlico y
en esparto (Chanda et al., 1950), en el tallo
p-cumárico.
 11

del tabaco (Eda et al., 1976), y en algunas
algas.
El xilano se encuentra unido a otros
componentes de la pared celular, actuando
como nexo de unión entre la lignina y el resto
de polímeros de la pared secundaria de las
plantas (Wong et al., 1988).
Puede unirse a la celulosa y a otras cadenas de
xilano y hemicelulosas mediante enlaces
covalentes y no covalentes (puentes de
hidrógeno y fuerzas de Van der Waals).
También puede unirse a la lignina mediante
enlaces covalentes (Dekker, 1989), que pueden
ser enlaces éter entre la lignina y los ácidos
cumárico y ferúlico esterificados a residuos de
arabinosa (arabinoxilanos
glucuronoarabinoxilanos), y enlaces éster entre
la lignina y el ácido 4-O-metil glucurónico
(glucuronoxilanos y glucuronoarabinoxilanos).
Las cadenas de arabinoxilanos
glucuronoarabinoxilanos además pueden
unirse entre ellas y con otras hemicelulosas y
lignina a través de la formación de diferulatos
(enlace covalente entre 2 residuos de ácido
ferúlico) tal como se puede apreciar en la
Figura IN.1.4 (Markwalder y Neukom, 1976).
1.3. Enzimas degradadoras de
xilano
La capacidad de degradar xilano está
ampliamente distribuida entre
microorganismos saprófítos, tanto bacterias
como hongos, así como entre la microbiota del
rumen. Estos microorganismos poseen
complejos sistemas enzimáticos para llevar a
cabo la degradación del xilano.
La necesidad de un conjunto amplio de
diferentes enzimas, cada una con un papel
definido y determinado, para la completa
degradación del xilano, es debida a la
heterogeneidad y elevada complejidad
estructural de éste (Biely, 1985; Coughlan y
Hazlewood, 1993).
Las enzimas degradadoras del xilano se
clasifican en dos grupos principales
(Figura IN.1.5):
- Enzimas implicadas en la
despolimerización del esqueleto principal
de xilosas: Endoxilanasas (β-1,4-D-xilan-
y xilanohidrolasas) y β-xilosidasas
(β-1,4-D-xilan-xilohidrolasas).
- Enzimas encargadas de la eliminación de
las cadenas laterales del xilano, llamadas
y también accesorias o desramificantes:
α-L-arabinofuranosidasas,
α-D-glucuronidasas, acetilxilano esterasas,
y ferúlico y p-cumárico esterasas
(hidroxicinámico esterasas).
Entre estas enzimas existe frecuentemente
relaciones de sinergismo, de modo que,
generalmente, las enzimas desramificantes
permiten una mayor accesibilidad de las
xilanasas al esqueleto principal de xilosas, y a
su vez estas enzimas accesorias liberan los
sustituyentes laterales más fácilmente a partir
los de fragmentos de xilano que no a partir del
xilano polimérico. De esta manera, se ha visto
que existe frecuentemente sinergismo entre
12

Figura IN.1.5: Enzimas necesarias para la degradación del xilano y lugares sobre los que actúan.

xilanasas y enzimas desramificantes, entre
xilanasas y β-xilosidasas, y entre diferentes
xilanasas (Coughlan et al., 1993; De Vries et
al., 2000).
enzimas intracelulares, aunque también las hay
extracelulares (Coughlan et al., 1993).
Muchas β-xilosidasas disponen además de
actividad transferasa o transxilosidasa (Lee y
Zeikus, 1993), por lo que pueden generar

1.3.1. β-xilosidasas productos de mayor tamaño que los

oligosacáridos iniciales, lo cual las hace de
Las β-1,4-xilosidasas (EC 3.2.1.37) son
interés para su utilización en biosíntesis de
enzimas que actúan sobre xilobiosa y
oligosacáridos (De Vries y Visser, 2001).
xilooligosacáridos cortos no sustituidos,
El mecanismo catalítico utilizado por estas
hidrolizando los enlaces β(1→4) y liberando
enzimas puede ser de inversión o de retención
así residuos de D-xilosa a partir del extremo
de la configuración anomérica. En este último
no reductor de estos sustratos (Reilly, 1981).
caso, para la hidrólisis del sustrato se produce
La afinidad de las β-xilosidasas por los
un doble desplazamiento, lo que permite a
xilooligosacáridos disminuye al aumentar el
algunas enzimas que usan este mecanismo de
grado de polimerización de éstos, no siendo
retención catalizar reacciones de
activas sobre el xilano polimérico.
transglicosilación (Rye y Withers, 2000).
Complementan pues la acción degradadora de
Las β-xilosidasas suelen ser de elevado peso
las endoxilanasas al romper los xilooligómeros
molecular (hasta 360 kDa) y pueden estar
que éstas generan a partir del xilano.
formadas por 2 o más subunidades (Coughlan
Dado que los oligosacáridos pueden penetrar
y Hazlewood, 1993).
dentro de la célula, las β-xilosidasas suelen ser
Pertenecen a las familias 3, 39, 43 y 52 de
glicosil hidrolasas.
 13

1.3.2. α-L-arabinofuranosidasas tamaño adecuado a partir del xilano. Sin

Estas enzimas (EC 3.2.1.55) liberan las embargo, hay excepciones a este hecho, como
moléculas de L-arabinosa unidas por enlaces por ejemplo una α-glucuronidasa de
α-1,2 o α-1,3 a las cadenas de xilosa del xilano Thermoascus aurantiacus, que presenta más
(Kaji, 1984) o a otros polisacáridos que actividad cuanto mayor es el grado de
contienen arabinosa (Saha, 2000). Con esta polimerización del xilano (Khandke et al.,
rotura permiten la creación de zonas no 1989).
ramificadas susceptibles entonces de ser Se encuentran exclusivamente dentro de la
atacadas por endoxilanasas, existiendo un familia 67 de glicosil hidrolasas.
importante sinergismo entre estas enzimas.
La especificidad de sustrato y del tipo de
1.3.4. Esterasas
enlace que hidrolizan varía mucho de una
Actúan hidrolizando los enlaces éster
α-L-arabinofuranosidasa a otra, siendo estas
presentes en el polímero de xilano.
características específicas de cada enzima.
Esto propicia el hecho de que un mismo
Las acetilxilano esterasas (EC 3.1.1.72)
microorganismo pueda producir múltiples
hidrolizan los enlaces que unen grupos acetilo
α-L-arabinofuranosidasas, cada una con
a residuos de xilosa del esqueleto principal del
diferentes propiedades físico-químicas (Tajana
xilano (Tenkanen y Poutanen, 1992).
et al., 1992).
La degradación completa del xilano requiere
Las α-L-arabinofuranosidasas han sido
necesariamente de este tipo de enzimas, puesto
clasificadas en las familias 43, 51, 54 y 62 de
que su acción permite la accesibilidad de otras
glicosil hidrolasas.
enzimas a la pared celular, así como al
esqueleto de xilosa del xilano (Coughlan et al.,
1.3.3. α-D-glucuronidasas 1993).
Las α-glucuronidasas (EC 3.2.1.131) eliminan
los residuos laterales de ácido glucurónico y Las ferúlico y p-cumárico esterasas, también
ácido 4-O-metil glucurónico, pero denominadas en conjunto como
generalmente sólo a partir de xilooligómeros hidroxicinámico esterasas, actúan sobre los
sustituidos, disminuyendo su actividad de enlaces que unen residuos laterales de
manera inversamente proporcional al grado de arabinosa a ácido ferúlico y cumárico,
polimerización de estos xilooligosacáridos respectivamente (Mackenzie et al., 1987).
(Puls et al., 1987), por lo que suelen requerir Permiten de esta manera romper uniones entre
de la acción de endoxilanasas que cadenas de xilano y entre la lignina y el xilano.
proporcionen xilooligómeros sustituidos del
14
1.4. Xilanasas
1.4.1. Características generales
Las endoxilanasas o xilanasas
(endo-β-1,4-xilanasas; EC 3.2.1.8) son las
enzimas que actúan sobre la cadena principal
del xilano hidrolizando los enlaces internos
β(1→4) entre moléculas de xilosa, dando lugar
a una mezcla de xilooligosacáridos de
diferentes tamaños (Biely, 1985). Además de
xilano pueden hidrolizar xilooligómeros de
diferente grado de polimerización (siendo más
activas cuanto mayor es el grado
polimerización) pero no hidrolizan
xilobiosa, lo que permite distinguirlas
claramente de las β-xilosidasas.
Las xilanasas son pues las principales enzimas
implicadas en la degradación del xilano.
En los microbios xilanolíticos hay una gran
multiplicidad de xilanasas (varios genes
distintos que además cada uno de ellos puede
dar lugar a diferentes xilanasas en función del
procesamiento post-transcripcional
post-traduccional), que difieren en
especificidad respecto al xilano (Wong et al.,
1988). Esta gran diversidad de xilanasas está
relacionada con el hecho de que el xilano es un
polímero muy complejo y se requieren
xilanasas distintas para degradar las diferentes
regiones del xilano y los diferentes xilanos.
Así, muchas xilanasas sólo pueden actuar
sobre regiones del xilano no sustituidas,
mientras que otras requieren un determinado
tipo de ramificación adyacente al sitio de corte
(Coughlan y Hazlewood, 1993).
Dado que el xilano es un polímero de elevado
grado de polimerización, no puede penetrar
dentro de los microorganismos para ser
degradado, de manera que las xilanasas han de
ser secretadas al medio extracelular,
normalmente mediante sistemas de secreción
de tipo II (“sec dependientes”, es decir, que
requieren del sistema de secreción Sec, el Sec
pathway) (Tjalsma et al., 2004). Sin embargo,
de en algunas bacterias del rumen y en Cellvibrio
la mixtus se han descrito xilanasas que no son
secretadas al espacio extracelular, quedando
localizadas en el espacio periplásmico (Fontes
et al., 2000). Probablemente, la función de
estas xilanasas periplásmicas no es la
degradación del xilano, sino la de
xilooligosacáridos de pequeño tamaño que
puedan atravesar la membrana externa,
estando protegidas al mismo tiempo de la
acción de las proteasas extracelulares.
y
su En algunos microorganismos, principalmente
anaeróbicos, las xilanasas pueden encontrarse
también formando parte de unas estructuras
extracelulares denominadas celulosomas. Los
celulosomas son complejos multienzimáticos
anclados en la superficie celular que permiten
a los microorganismos que los poseen la unión
a sustratos lignocelulósicos y el aumento de la
eficiencia degradadora de la celulosa y las
hemicelulosas (Bayer et al., 2004).

Los celulosomas contienen una proteína no
catalítica de andamiaje (scaffolding protein)
que por un lado permite el anclaje a la
superficie celular a través de una proteína de
anclaje (anchoring protein), por otro contiene
dominios cohesina (cohesin modules) para unir
las diferentes enzimas hidrolíticas que forman
el celulosoma, y además puede contener
módulos de unión a carbohidratos (CBM). A
parte de esta proteína de andamiaje, los
celulosomas presentan una gran cantidad de
enzimas hidrolíticas que se unen mediante
dominios de ensamblaje o acoplamiento
(docking or dockerin domains) a los dominios
cohesina previamente mencionados (Bayer et
al., 2004). La mayoría de las enzimas que
forman parte de los celulosomas son celulasas,
pero también se encuentran xilanasas (Pason
et al., 2006), otras glicosil hidrolasas, y en
algunos casos incluso esterasas (Shoham et al.,
1999). Todas estas enzimas actúan de manera
sinérgica para degradar el sustrato
lignocelulósico, el cual resulta fácilmente
accesible gracias a las uniones que establecen
Microorganismo Dominios
c ohesina
Xilanasas
Proteína
de anclaje CBM
Celulasas
Figura IN.1.6: Representación esquemática de un celulosoma.
15
con él los CBM presentes tanto en la proteína
de andamiaje como en algunas de las
subunidades enzimáticas (Figura IN.1.6).
El termino xilanosoma ha sido propuesto para
designar aquellas agrupaciones enzimáticas
extracelulares similares a celulosomas, en que
las enzimas mayoritarias son xilanasas en
lugar de celulasas (Beg et al., 2001; Jiang et
al., 2005).
En cuanto a la regulación de la expresión de
xilanasas, generalmente no son enzimas
constitutivas, induciéndose su expresión al
crecer el microorganismo en medios que
contienen xilano o xilobiosa. La xilosa es el
principal inductor de la expresión de los genes
de xilanasas (Biely, 1985), de manera que para
que un microorganismo pueda aprovechar el
xilano del medio, son necesarios pequeños
niveles de expresión basal de xilanasas que
puedan degradar en cierta medida el xilano,
liberándose finalmente las cantidades de xilosa
suficientes para inducir la expresión de las
Dominios de
ac oplamiento
Proteína de
andamiaje
CBM
Xilano
Celulosa
Xilano
16
xilanasas (Kulkarni et al., 1999; Stülke y
Hillen, 2000).
Además, en la mayoría de microorganismos la
expresión de xilanasas está sometida a
represión por catabolito, a través de la acción
del represor CreA (Cho y Choi, 1999; De
Vries y Visser, 2001), equivalente a CcpA en
especies del género Bacillus (Stülke y Hillen,
2000). Esto permite la utilización de fuentes de
carbono más fácilmente asimilables (como
glucosa y xilosa) cuando éstas se encuentran
disponibles en el medio.
De esta manera, la xilosa juega un doble papel
como regulador de la expresión de xilanasas,
en función de su concentración: a bajas
concentraciones de xilosa, ésta actúa como
inductor de la expresión de xilanasas, ya que
sólo ejerce una represión débil a través del
sistema CreA; pero a altas concentraciones, la
xilosa actúa reprimiendo la expresión de genes
xilanolíticos (a través del sistema CreA)
(De Vries et al., 1999).
No obstante, existen excepciones, como por
ejemplo una de las xilanasas de Bacillus
subtilis (Lindner et al., 1994) que presenta
expresión constitutiva durante el crecimiento
exponencial.
1.4.2. Clasificación de las xilanasas
Como ya se ha comentado, dada la
complejidad y heterogeneidad del xilano,
existe una gran variedad de xilanasas distintas,
que se diferencian en cuanto a su especificidad
de sustrato, su secuencia y su estructura.
En general, las xilanasas, tanto de bacterias
como de hongos, son mayoritariamente
monoméricas, y ampliamente variables en
cuanto a su peso molecular y punto
isoeléctrico (pI).
En base al peso molecular y el punto
isoeléctrico, Wong y colaboradores (1988)
dividieron las xilanasas en dos grupos:
– Un primer grupo de xilanasas de bajo peso
molecular (menos de 30 kDa) y pI alcalino.
– Un segundo grupo de xilanasas de mayor
peso molecular (más de 30 kDa) y pI
ácido.
Progresivamente, el número de xilanasas
caracterizadas fue en aumento, de manera que
empezaron a describirse enzimas con
características intermedias, y que por tanto no
encajaban en ninguno de estos dos grupos.
Gilkes y colaboradores (1991) realizaron un
estudio de las secuencias de xilanasas y
celulasas. Atendiendo principalmente a
homologías de secuencia, estas enzimas se
clasificaron en 9 familias, quedando las
xilanasas distribuidas en las familias F y G:
– La familia F incluye las xilanasas del
grupo de mayor peso molecular y bajo pI
definido por Wong y colaboradores (1988),
además de otras xilanasas y otras enzimas
como exocelulasas y endo-β-1,3-xilanasas.
– La familia G es una familia formada
exclusivamente por xilanasas, entre las que
se incluyen las xilanasas de bajo peso

molecular y alto pI (Wong et al., 1988),
además de otras xilanasas.
Posteriormente, las glicosil hidrolasas se
clasificaron en 35 familias en base a
comparación de secuencias (Henrissat, 1991) y
al análisis de las regiones de hidrofobicidad de
las mismas (Henrisat y Bairoch, 1993, 1996).
Estudios posteriores han corroborado que, tal
como sugerían éstos y otros autores en
estudios previos (Chothia y Lesk, 1986), existe
una correlación entre la secuencia primaria de
una proteína y su conformación
tridimensional.
Actualmente existen más de 100 familias de
glicosil hidrolasas (Carbohydrate Active
enZYmes database, http://www.cazy.org/;
Coutinho y Henrissat, 1999), las cuales se
encuentran agrupadas en diferentes clanes o
superfamilias (grupos de familias que
comparten un motivo de plegamiento terciario,
aminoácidos catalíticos conservados y similar
mecanismo catalítico; hechos que sugieren un
origen evolutivo común).
En base a esta clasificación, las xilanasas
quedan distribuidas en las familias 10 y 11,
que se corresponden con las familias F y G de
Gilkes y colaboradores (1991).
La diferencia entre estas 2 familias de
xilanasas se encuentra principalmente a nivel
de secuencia y estructura tridimensional, no
existiendo diferencias importantes a nivel de
sus características catalíticas. No obstante, las
diferencias estructurales influyen de manera
17
determinante en algunas características físico-
químicas de estas enzimas. Así, la estructura
tridimensional del centro activo de las
xilanasas de la familia 10 hace que estas sean
menos estrictas en cuanto al sustrato y más
activas sobre xilooligosacáridos de bajo grado
de polimerización que las xilanasas de la
familia 11 (Biely et al., 1997; Leggio et al.,
2000; Sabini et al., 2001).
Un pequeño número de xilanasas
caracterizadas más recientemente no presenta
homología de secuencia con las familias
clásicas de xilanasas 10 u 11, y en su lugar
presentan homología con otras familias de
glicosil hidrolasas, como las familias 5, 7, 8 y
43 (Collins et al., 2005).
Por último, cabe mencionar que se ha descrito
un tipo de xilanasas con un modo de acción
tipo exo, que se han denominado exoxilanasas
(Reilly, 1981; Kubata et al., 1995). En estas
enzimas, el ataque de la molécula de xilano se
produciría a partir de un extremo de la misma
(y no en el interior de la molécula como
sucede en las endoxilanasas), generándose un
único tipo de xilooligosacárido como producto
de la hidrólisis del xilano. Este modo de
acción equivaldría a la degradación procesiva
de celulosa por parte de las exocelulasas
(Sánchez et al., 2003). De todas formas, la
existencia de auténticas exoxilanasas no ha
sido admitida unánimemente debido a que un
mecanismo catalítico de este tipo requeriría
18

primero la eliminación de todos los En el caso de las xilanasas de las familias 10 y

sustituyentes laterales de la cadena de xilosas. 11 el mecanismo utilizado en la hidrólisis del
Por ello, el uso del término exoxilanasas no es sustrato es el de doble desplazamiento con
aceptado formalmente. retención de la configuración anomérica
(β→β) (Figura IN.1.7).

1.4.3. Mecanismo catalítico

El mecanismo catalítico de la mayoría de
glicosil hidrolasas consiste o bien en un
desplazamiento simple (que produce
inversión de la configuración anomérica), o
bien en un doble desplazamiento (que conlleva
la retención de la configuración anomérica)
(Rye y Withers, 2000; Yip y Withers, 2004).
En la hidrólisis del enlace glucosídico por este
mecanismo intervienen 2 residuos glutamato
conservados del centro activo de la xilanasa,
la separados entre sí 5,4 - 5,5 Å, actuando uno de
ellos como catalizador ácido/base y el otro
como residuo nucleófilo (Davies y Henrissat,
1995).

A C

Figura IN.1.7: Mecanismo catalítico de retención en xilanasas de las familias 10 y 11.

 19

Una vez el esqueleto de xilosas ha sido
posicionado correctamente entre los dos ácidos
glutámicos catalíticos, uno de ellos (el
catalizador ácido/base) realiza un ataque ácido
sobre el enlace glucosídico, protonando el
oxígeno de dicho enlace, mientras el otro
glutamato realiza un ataque nucleofílico sobre
el carbono anomérico del enlace
(Figura IN.1.7.A). El resultado de este primer
paso es la liberación de uno de los productos
de reacción y la formación de un intermediario
α-glicosilo-enzima.
A continuación, el glutamato ácido/base pasa a
actuar como base, “robándole” un protón a una
molécula de agua, lo que permite que ésta
ataque el enlace entre el glutamato nucleófilo
y el carbono anomérico (Figura IN.1.7.B),
produciendo su hidrólisis, y dando como
resultado un producto cuyo carbono anomérico
vuelve a la misma configuración que en el
sustrato (β→β), liberándose la enzima de su
unión al sustrato para poder iniciar un nuevo
proceso de catálisis (Figura IN.1.7.C) (Davies
y Henrissat, 1995; Collins et al., 2005).
En el caso de las xilanasas pertenecientes a las
familias 5 y 7, el mecanismo catalítico es
similar al de las familias 10 y 11.
Por el contrario, las enzimas de las familias 8 y
43 de glicosil hidrolasas (entre las que se
incluyen algunas xilanasas de reciente
caracterización) utilizan el mecanismo de
desplazamiento simple, lo que comporta la
inversión de la configuración del carbono
anomérico (β→α). En este caso, los residuos
aminoacídicos implicados en la hidrólisis del
enlace glucosídico no serían dos glutamatos
sino un glutamato y un aspartato, actuando uno
como catalizador ácido y otro como
catalizador básico.
En este tipo de hidrólisis en un solo
desplazamiento, es necesaria una distancia
mayor entre los aminoácidos catalíticos
(alrededor de 9,5 - 10 Å), para que entre ellos
se pueda disponer el sustrato con el enlace
glucosídico a romper junto con una molécula
de agua que ha de posicionarse entre el
carbono anomérico de dicho enlace y el
catalizador básico (Figura IN.1.8).

Ácido Base

A B

9,5 Å

Base Ácido
Intermediario
temporal

Figura IN.1.8: Mecanismo catalítico de inversión en glicosil hidrolasas de las familias 8 y 43.
20

1.4.4. Estructura (fibronectin type 3-like repeats)

(Kataeva et al., 2002).
1.4.4.1. - Arquitectura Molecular La xilanasa XynC de Paenibacillus
Atendiendo a su arquitectura molecular, al barcinonensis (Blanco et al., 1999) sería
igual que muchas otras enzimas, las xilanasas un ejemplo de xilanasa multidominio.
se pueden dividir en:
– Enzimas de un sólo dominio estructural y En las xilanasas modulares los dominios más
funcional: sólo contienen el dominio abundantes después de los dominios catalíticos
catalítico. La xilanasa Xyn10A de Bacillus son los módulos de unión a carbohidratos
halodurans (Hatti-Kaul et al., 2006), con (CBM), que median la unión de estas enzimas
su único dominio catalítico perteneciente a a carbohidratos. Estos CBM se encuentran
la familia 10 de glicosil hidrolasas sería un clasificados en familias en base a similitud de
ejemplo. secuencia de aminoácidos (Boraston et al.,
– Enzimas multidominio o modulares: 2004). En general son bastante específicos en
además del dominio catalítico contienen cuanto al tipo de carbohidrato que reconocen,
otros dominios unidos entre sí mediante pero existen variaciones en esta afinidad.
secuencias conectoras (linkers). Estos Los primeros CBM que se caracterizaron
dominios no catalíticos independientes fueron los dominios de unión a celulosa
pueden ser: (CBD), que median la unión a diferentes
• Módulos de unión a carbohidratos formas de celulosa amorfa o cristalina, y
(carbohydrate binding modules, además pueden ayudar a desorganizar las
CBM), que permiten la unión a microfibrillas de celulosa cristalina, facilitando
celulosa (cellulose binding domains, la acción de las celulasas (Linder y Teeri,
CBD), a xilano (xylan binding 1997; Tomme et al., 1998). La eliminación de
domains, XBD), o a otros los CBD puede disminuir la actividad
carbohidratos poliméricos. hidrolítica de las celulasas. Así, como ejemplo,
• Dominios de ensamblaje o en el caso de los CBD de la familia IIIc
acoplamiento (docking domains), para (CBM3c) asociados a dominios glicosil
mediar la unión a proteínas de hidrolasa de la familia 9, su eliminación causa
andamiaje de celulosomas o una drástica disminución de la capacidad
xilanosomas. hidrolítica de estas celulasas sobre celulosa
• Dominios con funciones no totalmente cristalina, ya que la función de estos CBM3c
conocidas, como los dominios SLH sería ayudar a la aproximación del sustrato al
(surface layer homology domains) (St. centro activo de la enzima, y en algunos casos,
John et al., 2006a) o los dominios Fn3 ayudarían también a que estas enzimas
 21

actuaran de manera procesiva sobre el sustrato

A
(Irwin et al., 1998; Bayer et al., 2000).
Existen también CBM que median la unión a
xilano: dominios de unión al xilano (XBD).
Uno de los primeros XBD identificados fue el
de la xilanasa D (XylD) de Cellulomonas fimi
(Black et al., 1995). Dentro de este grupo de
CBM, se incluyen también dominios
previamente considerados como putativos
dominios de termoestabilidad (Clarke et al., B
1996; Blanco et al., 1999), que posteriormente
han sido identificados como dominios de
unión a xilano (Sunna et al., 2000),
clasificándose dentro de la familia CBM22.
Además de los CBD y los XBD
(Figura IN.1.9), se han identificado otros CBM
que median la unión a otros carbohidratos
como la quitina, el almidón, los mananos, los
galactanos y algunos glicanos de superficie
Figura IN.1.9: (A) Estructura en β jelly roll (típica
celular (Boraston et al., 2004). de gran número de CBMs) de un CBD de la
familia IV (CBM4) unido a celopentaosa (Boraston
et al., 2002), y (B) de un XBD de la familia XIII
(CBM13) con plegamiento en β trefoil de 12
1.4.4.2. - Estructura Tridimensional hebras β (Notenboom et al., 2002).

Existe gran cantidad de xilanasas fúngicas y familia, que engloba a aquellas familias de
bacterianas de las familias 10 y 11 cuya proteínas que comparten una estructura
estructura tridimensional ha sido resuelta, y terciaria similar, y que a su vez conservan los
también, aunque en menor número, ha sido aminoácidos catalíticos y el mecanismo
determinado experimentalmente el enzimático. Así, mientras las familias agrupan
plegamiento de bastantes xilanasas de las proteínas principalmente en función de su
familias 5 y 8. similitud de secuencia, los clanes o
superfamilias agrupan familias de proteínas
Las familias 5 y 10 de glicosil hidrolasas son básicamente en función de sus similitudes
miembros del clan GH-A, junto a otras 15 estructurales (Henrissat y Bairoch, 1996).
familias más. El clan o superfamilia, es un Los miembros del clan GH-A, a pesar de sus
nivel jerárquico de clasificación superior a la diferencias en tamaño y secuencia, presentan
22

un dominio catalítico de 250 a 450

aminoácidos con un plegamiento de tipo barril
(α/β)8 o TIM-barrel, consistente en 8 regiones
de conformación β dispuestas en el interior en
forma cilíndrica o de barril, rodeadas a su vez
de 8 hélices α. Asimismo, los miembros de
este clan tiene un surco catalítico altamente
conservado.
En el caso de las xilanasas de la familia 10, la
mayoría son enzimas multidominio que Figura IN.1.10: Estructura 3D de la xilanasa
multidominio Xyn10C de Cellvibrio japonicus
presentan dominios de unión a carbohidratos (Pell et al., 2004a) perteneciente a la familia 10 de
glicosil hidrolasas (GH10). Se puede observar el
enlazados mediante linkers flexibles al modulo de unión a carbohidratos (CBM), a la
dominio catalítico. Posiblemente ha sido la izquierda, y el dominio catalítico con plegamiento
en barril (α/β)8, a la derecha.
presencia de estos linkers flexibles la que ha Entre ambos dominios debería observarse el
linker, pero su elevada flexibilidad dificulta su
dificultado la cristalización y obtención de resolución estructural.
estructuras tridimensionales de xilanasas
modulares completas de esta familia. Así,
salvo en los casos concretos de Xyn10A de
Streptomyces olivaceoviridis (Fujimoto et al.,
2000) y de Xyn10C de Cellvibrio japonicus
(Pell et al., 2004a), el resto de estructuras
resueltas para miembros de la familia 10
corresponden a dominios individuales
cristalizados por separado (Figura IN.1.10).
Respecto a la familia 5, se ha resuelto la
estructura de la xilanasa A de Erwinia
chrysanthemi, la cual contendría, además del
Figura IN.1.11: Estructura 3D de la xilanasa
dominio catalítico con estructura de barril multidominio XynA de Erwinia chrysanthemi
(Larson et al., 2003) perteneciente a la familia 5 de
(α/β)8, un putativo dominio de unión a xilano glicosil hidrolasas (GH5). Se puede observar en
en su región C-terminal (Larson et al., 2003). C-terminal, a la izquierda, un putativo modulo de
unión a carbohidratos (CBM) además del dominio
Así pues, la estructura de esta xilanasa de la catalítico con plegamiento en barril (α/β)8, a la
derecha.
familia 5 podría confundirse con la de una
xilanasa de la familia 10 (Figura IN.1.11). La familia 11 de glicosil hidrolasas pertenece
al clan GH-C, al cual pertenece también la
familia 12, formada básicamente por celulasas.

Las xilanasas de la familia 11 presentan
dominios catalíticos de 180 a 200 aminoácidos
que se pliegan en una conformación de
lámina β curvada sobre sí misma, conocida
como β jelly roll (Figura IN.1.12).
Figura IN.1.12: Estructura 3D de la xilanasa
Xyn11X de Bacillus subtilis B230, de la familia 11
de glicosil hidrolasas (GH11) (Oakley et al.,
2003). Se puede observar el plegamiento en β jelly
roll del dominio catalítico.
Estas xilanasas suelen contener únicamente el
dominio catalítico, aunque hay excepciones,
como el caso de TfxA de Thermomonospora
fusca que posee un CBM unido al dominio
catalítico (Irwin et al., 1994).
Actualmente, sólo se conoce la estructura de 2
xilanasas de la familia 8, la xilanasa psicrófila
pXyl de Pseudoalteromonas haloplanktis y la
supuesta exoxilanasa Rex (también
denominada xilanasa Y) de Bacillus
halodurans C-125 (Van Petegem et al., 2003;
Honda y Kitaoka, 2004; respectivamente).
Esta familia de glicosil hidrolasas pertenece al
clan GH-M, conjuntamente con la familia 48
23
de glicosil hidrolasas. Al igual que en el resto
de proteínas de dicho clan, el dominio
catalítico de estas xilanasas presenta un
plegamiento en barril (α/α)6, consistente en 6
hélices α en el centro del barril, rodeadas por
otras 6 hélices α (Figura IN.1.13). Este
plegamiento también está presente en otras
glicosil hidrolasas que usan el mecanismo
catalítico de inversión, como las pertenecientes
al clan GH-L (familias 15 y 65) y a la
familia 9.
Figura IN.1.13: Estructura 3D de la xilanasa
pXyl de la bacteria antártica Pseudoalteromonas
haloplanktis (Van Petegem et al., 2003),
perteneciente a la familia 8 de glicosil hidrolasas
(GH8). Se puede observar el plegamiento en barril
(α/α)6 del dominio catalítico.
No se conoce la estructura de las xilanasas de
las familias 7 y 43, aunque es de esperar que la
xilanasa A de Penicillium funiculosum,
perteneciente a la familia 7, presente un
dominio catalítico con plegamiento en β jelly
roll, como las enzimas ya cristalizadas de esta
familia (Figura IN.1.14); y que igualmente las
xilanasas de la familia 43 presenten un
dominio catalítico con plegamiento muy
24

parecido al que presentan las proteínas ya

cristalizadas de la familia 43, denominado
5-fold β-propeller (o 5-blade β-propeller), y
consistente en un superbarril de 5 laminas β
antiparalelas formadas cada una por 4 hebras β
(Collins et al., 2005) (Figura IN.1.15).

Figura IN.1.15: Estructura 3D de la

exoarabinanasa Arb43A de Cellvibrio japonicus
(Proctor et al., 2005), perteneciente a la familia 43
de glicosil hidrolasas (GH43). Se puede observar
el plegamiento en 5-fold β-propeller del dominio
catalítico.

El centro activo de las xilanasas consiste en

una hendidura más o menos profunda,
localizada en la superficie de la proteína, y
generalmente bastante amplia. Estas
Figura IN.1.14: Estructura 3D de la características concuerdan con el modo de
endoglucanasa I (EG I) del hongo termófilo acción de tipo endo de las xilanasas.
Fusarium oxysporum (Sulzenbacher et al., 1997),
perteneciente a la familia 7 de glicosil hidrolasas Normalmente esta hendidura catalítica o surco
(GH7). Se puede observar el plegamiento en
β jelly roll del dominio catalítico. catalítico contiene entre cuatro y siete subsitios
de unión.
Los subsitios de unión se encargan de
posicionar correctamente los anillos de
1.4.4.3. - Estructura del centro activo
xilopiranosa del sustrato de manera que el
Las estructuras de diferentes xilanasas salvajes
enlace a hidrolizar quede a la distancia y en la
y mutantes unidas a oligosacáridos e
orientación correctas respecto a los
inhibidores han permitido estudiar el centro
aminoácidos catalíticos.
activo de estas enzimas, cómo se une el
Estos subsitios de unión se designan por un
sustrato a éste, y el mecanismo de catálisis
número que depende de su posición respecto a
(Leggio et al., 2000; Sabini et al., 2001).
los aminoácidos del centro catalítico:
 25

– Los subsitios más cercanos al centro glucuronoxilano y xilano β-1,3-β-1,4

catalítico reciben un número más bajo, (rhodimenano), lo que indicaría la existencia
comenzando por +1 ó -1. Los subsitios +1 de un sitio de unión más pequeño en estas
y -1 flanquean el enlace a hidrolizar. xilanasas (Kolenová et al., 2005).
– Los situados hacia el extremo no reductor
del sustrato reciben números negativos, y La estructura del centro activo también resulta
los situados hacia el extremo reductor del importante a la hora de discriminar
sustrato (aglycone) números positivos. sustituyentes laterales en la cadena de xilano.
De estos subsitios, son el -1 y el -2 los más Se ha descrito que las xilanasas de la familia
conservados en las familias 10 y 11 de 11 acostumbran a hidrolizar regiones no
xilanasas, siendo mucho más variables los sustituidas de la cadena de xilosas, mientras
subsitios positivos. que las xilanasas de la familia 10 son capaces
de degradar el polisacárido en aquellas
A parte de las similitudes, existen también regiones con sustituyentes laterales (Leggio et
diferencias estructurales importantes en el al., 2000; Sabini et al., 2001).
centro activo entre las xilanasas de la familia Estudios recientes, en los cuales se han
10 y la familia 11. Así, en las xilanasas de la cristalizado xilanasas de la familia 10
familia 10 el lugar de unión al sustrato es una acomplejadas con sustratos que contenían
hendidura poco profunda (shallow groove), diferentes sustituyentes laterales, han
mientras que en las de la familia 11 el lugar de permitido comprobar como las xilanasas de
unión al sustrato es una hendidura más esta familia presentan subsitios de unión al
profunda (deep cleft). sustrato capaces de acomodar sustituyentes de
Estas diferencias estructurales en la hendidura α-L-arabinofuranosa y ácido
catalítica hace que las xilanasas de la familia 4-O-metil-α-D-glucurónico (los más
10 sean menos estrictas en cuanto al sustrato, abundantes), permitiendo además evitar la
mostrando una mayor versatilidad catalítica formación de productos de punto muerto
que las xilanasas de la familia 11. Esta menor (dead-end) y facilitando la posterior actuación
especificidad de sustrato permite que algunas de enzimas desramificantes, como las
xilanasas de la familia 10 muestren actividad α-D-glucuronidasas, sobre los productos
sobre sustratos celulósicos tales como los sustituidos resultantes (Pell et al., 2004b).
aril-celobiósidos (Biely et al., 1997). Algunos autores llegan incluso a sugerir que
Además, las xilanasas de la familia 10 son más algunos de estos sustituyentes laterales
activas sobre xilooligosacáridos de bajo grado actuarían como determinantes de especificidad
de polimerización, y liberan productos de para esta familia de xilanasas, debido a las
hidrólisis más pequeños a partir de estrechas interacciones que se han observado
26

entre estos sustituyentes y los subsitios de biotecnológica de xilanasas. Sus primeros usos
unión del centro activo que los acomodan en este sentido consistieron en su adición a las
(Vardakou et al., 2005). formulaciones de piensos animales,
expandiéndose después su utilización a las
industrias de alimentación, textil y papelera.
1.4.5. Aplicaciones de las xilanasas
Desde entonces el uso biotecnológico de estas
Los sistemas enzimáticos microbianos enzimas se ha incrementado de manera
suponen actualmente un importante potencial importante, cubriendo un amplio rango de
biotecnológico aplicable en numerosas sectores industriales. Así, en la actualidad, las
industrias en el ámbito de las denominadas xilanasas juntamente con celulasas y
tecnologías limpias o tecnologías sostenibles. pectinasas representan el 20% del mercado
En ellas se han introducido etapas global de enzimas industriales (Polizeli et al.,
biotecnológicas en procesos productivos 2005).
convencionales para dar lugar a unos procesos
de producción alternativos de impacto El xilano está presente en grandes cantidades
ambiental minimizado. Las industrias que más en los desechos de las industrias
se han beneficiado o se pueden beneficiar de la agroalimentarias, por lo que las xilanasas
aplicación de enzimas son principalmente las juegan un papel importante en la
papeleras, textiles, agrícolas y de alimentación, bioconversión de estos residuos ricos en
aunque recientemente está aumentando el lignocelulosa (incluyendo residuos sólidos
interés por parte de industrias de urbanos) en xilosa y otros azúcares
bioconversión y síntesis de nuevos fermentables para la producción de etanol
compuestos. (biofuel) (Lee, 1997; Sun y Cheng, 2002; St.
John et al., 2006a). Otro campo prometedor
En este sentido, las hemicelulasas bacterianas, para el uso de xilanasas es la bioconversión de
y en especial las xilanasas, tienen importantes xilano a xilitol, un edulcorante bajo en calorías
aplicaciones en la industria debido a su utilizado también en salud dental y como
enorme potencial para modificar y transformar laxante (Parajo et al., 1998; Polizeli et al.,
la lignocelulosa y otros materiales de la pared 2005).
celular vegetal, muy abundantes en la biomasa Otras aplicaciones potenciales de las xilanasas,
vegetal, ampliamente utilizada como materia pero menos documentadas, incluyen su uso
prima en un gran número de procesos como aditivos de detergentes, en la producción
industriales. de oligosacáridos farmacológicamente activos
Fue en la década de los 80 del pasado siglo como antioxidantes, en la preparación de
XX cuando comenzó la aplicación protoplastos a partir de células vegetales, y en

la síntesis de nuevos tensioactivos gracias a la
actividad transxilosidasa que poseen algunas
xilanasas (Bhat, 2000; Collins et al., 2005). En
la industria textil también pueden utilizarse las
xilanasas conjuntamente con las pectinasas
para degradar la hemicelulosa y pectina de
materias primas vegetales como lino o
cáñamo, liberándose así las fibras de celulosa
para la fabricación del tejido. Actualmente este
proceso se realiza mediante el enriado,
consistente en sumergir las fibras textiles en
agua para que puedan actuar los
microorganismos degradadores. El problema
del enriado por microorganismos es su lentitud
y dependencia de las condiciones
climatológicas, de manera que el empleo de
enzimas supondría una alta reproducibilidad
del proceso, mejor producción y mayor
resistencia de las fibras (Hoondal et al., 2002).
Tal como se ha mencionado anteriormente, las
xilanasas se utilizan ampliamente como
aditivos de piensos para animales
monogástricos (como cerdos y gallinas), junto
a otras enzimas despolimerizantes (celulasas y
pectinasas), para aumentar el valor nutricional
de los piensos. En estos casos, la degradación
de los arabinoxilanos contenidos en este tipo
de piensos reduce la viscosidad del material,
con lo que se facilita el tránsito intestinal y la
absorción de otros nutrientes, además de
potenciar la asimilación de los oligosacáridos
resultantes de la degradación del xilano
(Polizeli et al., 2005). De esta manera, se ha
observado que la incorporación de xilanasas en
27
piensos para pollos basados en trigo y centeno
aumenta la eficiencia de conversión de la
comida suministrada, y por tanto el peso de los
pollos (Bedford y Classen, 1992). Beneficios
similares pueden obtenerse en la alimentación
de cerdos gracias a dietas basadas en trigo
suplementadas con xilanasas y fosfolipasas
(Diebold et al., 2005).
En la industria vinícola y de zumos la
aplicación de xilanasas junto con pectinasas
facilita la extracción y clarificación del
producto final (Bhat, 2000). Además, estas
enzimas pueden incrementar la estabilidad de
la pulpa y la liberación de precursores
aromáticos. En este sentido, se ha comprobado
que el uso de levaduras recombinantes que
expresan la xilanasa XlnA de Aspergillus
nidulans permite obtener un vino con mayor
aroma afrutado (Ganga et al., 1999).
También pueden utilizarse xilanasas en la
elaboración de cervezas para reducir la
viscosidad y turbidez de éstas, y mejorar a la
vez el filtrado de la malta (Polizeli et al.,
2005).
Como aditivos en panificación, las xilanasas
degradan las hemicelulosas de la harina, lo que
resulta en una redistribución del agua de los
pentosanos al gluten, hecho que acaba
comportando un aumento del volumen y de la
calidad de la miga, además de un aumento en
la durabilidad del pan (Linko et al., 1997).
Estos efectos pueden incrementarse aún más si
se usan amilasas en combinación con las
xilanasas (Monfort et al., 1996).
28

cloro para obtener el mismo grado de blancura

Actualmente, la principal aplicación industrial y calidad en la pasta de papel, reduciéndose de
de las xilanasas se da en la industria papelera. esta forma la generación de residuos
En ella, el tratamiento con xilanasas de la organoclorados (AOX) un 15 - 20% (Viikari et
pasta de papel, previo al blanqueo químico, al., 2001; Bajpai, 2004). Además, la reducción
comporta importantes beneficios económicos y en la cantidad de agentes químicos requeridos
ventajas medioambientales (Viikari et al., para el blanqueo ha contribuido a la
1994, 2001; Bajpai, 2004). sustitución del cloro elemental (Cl2) por el
Un elevado porcentaje de las pastas papeleras dióxido de cloro (ClO2), mucho menos
son obtenidas por el proceso de cocción kraft contaminante, dando lugar a las secuencias de
(altas temperaturas y condiciones alcalinas), blanqueo ECF (elemental chlorine free), o
que tiene por objetivo liberar las fibras de incluso a la eliminación total de compuestos
celulosa mediante la solubilización de la clorados y su reemplazo por otros agentes
lignina. Pero la lignina residual, que queda en blanqueantes como el peróxido de hidrógeno
la pasta de papel tras la cocción kraft, produce (H2O2) y el ozono (O3), en las denominadas
un color oscuro, por lo que la pasta de papel ha secuencias de blanqueo TCF (total chlorine
de someterse a un tratamiento de blanqueo free).
para poder fabricar papel de calidad. El
proceso de blanqueo se realiza Se ha evaluado la actividad como
tradicionalmente con cloro y derivados potenciadoras del blanqueo de diferentes
clorados (hipoclorito y dióxido de cloro), que xilanasas fúngicas y bacterianas, observándose
reaccionan con la lignina y la solubilizan, que a pesar de la elevada eficiencia de muchas
dando lugar a la formación de compuestos de las enzimas ensayadas, existen notables
organoclorados (AOX: adsorbable organic diferencias entre ellas, en función de la familia
halogens), los cuales resultan altamente a que pertenecen y de las características
tóxicos. particulares de cada xilanasa (factores
Las xilanasas no eliminan directamente los endógenos de la enzima) (Elegir et al., 1995;
cromóforos de lignina residual, pero facilitan Clarke et al., 1997). Asimismo, se ha
su extracción de la pasta de papel al degradar constatado que el tipo de madera utilizada, el
el xilano, presente en los complejos método de pasteado y la secuencia de
xilano-lignina o reprecipitado sobre las fibras blanqueo elegida (factores exógenos) también
tras la cocción kraft. De esta manera, la influyen de manera significativa en la
aplicación de xilanasas potencia el blanqueo eficiencia de las xilanasas (Suurnäkki et al.,
químico posterior, por lo que su utilización 1996; Christov et al., 2000). En la actualidad
permite reducir un 20 - 25% el empleo de existen diversas xilanasas microbianas

disponibles en el mercado que se utilizan de
manera regular para el blanqueo en empresas
papeleras (Beg et al., 2001).
La aplicación de xilanasas en el blanqueo de
pastas papeleras puede modificar
propiedades del refino de éstas, observándose
en algunos casos que las pastas tratadas
enzimáticamente requieren un mayor número
de revoluciones en el proceso de refinado para
alcanzar las mismas propiedades que las pastas
no tratadas (Vicuña et al., 1995). También se
ha observado que la hidrólisis del xilano ayuda
al desgote posterior de las pastas, durante la
elaboración del papel, ya que se reduce la
retención de agua por las hemicelulosas. En
cualquier caso, las propiedades físicas de
resistencia del papel obtenido no se ven
afectadas de manera significativa por la
aplicación de xilanasas (Roncero et al., 2003).
En relación con el efecto de las xilanasas sobre
la blancura del papel, se ha visto que su
utilización puede reducir además
envejecimiento o el amarilleamiento
reversión del grado de blancura) del papel
procedente de pastas kraft. La reversión del
grado de blancura en pastas blanqueadas se
debe en gran medida a la temperatura de
conservación del papel y a la presencia en éste
29
de ácidos hexenurónicos (HexA). Estos HexA
se pueden originar a partir de los grupos de
ácido 4-O-metil-α-D-glucurónico, presentes en
los xilanos, durante el proceso de cocción kraft
(Figura IN.1.16); de manera que al reducir el
las xilano de estas pastas mediante el uso de
xilanasas se reduce también el contenido de
HexA y por tanto puede aumentar la
estabilidad del papel frente al envejecimiento
(Buchert et al., 1997).
A parte de las xilanasas, se han ensayado otras
hemicelulasas en el blanqueo de pastas
papeleras, obteniéndose diversos resultados.
Se ha observado así que las β-mananasas
también facilitan el blanqueo al ayudar a
eliminar la lignina residual y aumentar el
grado de blancura del papel. Sin embargo,
generalmente el efecto de las β-mananasas
sobre la blancura no es tan pronunciado como
el de las xilanasas (Bhat, 2000; Montiel et al.,
2002).
el
(la Otra estrategia más reciente para el blanqueo
enzimático de pastas papeleras consiste en
eliminar directamente la lignina residual
utilizando para ello enzimas degradadoras de
lignina (lacasas y peroxidasas). Los avances en
el conocimiento del modo de actuación de
Figura IN.1.16: Formación de
ácido hexenurónico (derecha) a
partir de ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico
(izquierda) presente en el xilano
(Petit-Breuilh et al., 2004).
30

estas enzimas ha permitido ensayar con éxito

lacasas fúngicas y de Streptomyces para el
blanqueo (Burbonnais et al., 1997; Arias et al.,
2003; Sigoillot et al., 2005; González Arzola
et al., 2006), aunque en estos casos, es
necesaria la presencia de un mediador para
obtener buenos resultados.

Volviendo a las xilanasas y sus aplicaciones en

la industria papelera, es preciso comentar que
éstas no se restringen al blanqueo. Los buenos
resultados obtenidos en esta etapa del proceso
de elaboración del papel han propiciado su
ensayo en otras etapas, como pueden ser el
pasteado mecánico, el drenaje o desgote de la
pasta, o el destintado de las fibras de papel
reciclado. Los prometedores resultados
obtenidos están determinando una expansión
del uso de xilanasas en la industria, con el
consiguiente aumento de la importancia de
éstas en el mercado mundial de enzimas.
 31

- La construcción de una genoteca en

2 - OBJETIVOS E INTERÉS DEL
Escherichia coli de la cepa Bacillus sp.
TRABAJO REALIZADO BP-7, previamente aislada y caracterizada
en el grupo de investigación (López et al.,
Dado el interés de la aplicación de enzimas
1998), y la selección de los clones
como las xilanasas en la industria, en las
recombinantes portadores de genes
denominadas tecnologías limpias, así como el
codificantes de xilanasas.
interés por ampliar el conocimiento de los
aspectos básicos de biología molecular de - La identificación y caracterización genética
estas enzimas, el presente trabajo se enmarca y bioquímica de las enzimas codificadas en
dentro de un proyecto más amplio que tiene estos genes.
por objeto la búsqueda y caracterización de
enzimas microbianas con actividades Los capítulos I y II del presente trabajo
degradadoras sobre diferentes polímeros abarcan estos objetivos.
vegetales y el estudio de su aplicación en
procesos industriales.
2.2. Caracterización de la
Por ello, nos planteamos dos objetivos
principales:
xilanasa B (XynB) de
– Por un lado, la identificación y Paenibacillus barcinonensis y
caracterización de nuevas enzimas sobreexpresión en huéspedes
xilanolíticas. homólogos
– Y por otro lado la sobreexpresión de
Uno de los factores necesarios para facilitar la
xilanasas y el estudio y mejora de sus
aplicación y el estudio de enzimas es que éstas
características, con el fin de posibilitar su
puedan obtenerse de manera económica y en
aplicación industrial.
alta cantidad. Por ello son importantes los
ensayos de sobreexpresión de enzimas. Así
Estos objetivos principales se concretaron en
pues, los objetivos de este apartado fueron:
los apartados que se describen a continuación.
- El análisis detallado de la especificidad de
sustrato de la xilanasa B (XynB) de
2.1. Clonación e identificación de Paenibacillus barcinonensis. Esta xilanasa
había sido previamente caracterizada en el
xilanasas de Bacillus sp. BP-7
grupo de investigación y presentaba una
Con el fin de encontrar y caracterizar nuevas
actividad sobre aril-xilósidos inusualmente
xilanasas, los objetivos de este apartado
alta (Blanco et al., 1996).
fueron:
32

- La clonación de XynB de Paenibacillus

barcinonensis en vectores lanzadera
E. coli - Bacillus subtilis para su
transformación en cepas huéspedes de
Bacillus subtilis y el estudio de su
expresión en las cepas recombinantes
obtenidas.

Estos objetivos quedan cubiertos por los

resultados que se presentan en el capítulo III.

2.3. Estudio estructural e

ingeniería de proteínas con XynB
de Paenibacillus barcinonensis
Para profundizar en el conocimiento de esta
enzima, así como para mejorar sus cualidades
para una posible aplicación en la industria, se
decidió realizar estudios de estructura-función
y experimentos de ingeniería de proteínas.
En base a esto, los objetivos generales de este
apartado fueron:
- El análisis estructural y el estudio de la
relación estructura-función en la xilanasa B
de Paenibacillus barcinonensis.
- Ensayos de mutagénesis dirigida y
mutagénesis aleatoria (PCR mutagénica y
gene shuffling) para aumentar la
termoestabilidad de la xilanasa B.

Los resultados presentados en el capítulo IV

del presente trabajo comprenden estos últimos
objetivos.
MATERIALES Y MÉTODOS

1. MICROORGANISMOS UTILIZADOS
Las enzimas estudiadas en el presente trabajo
provienen de las cepas bacterianas
Paenibacillus barcinonensis BP-23 (Blanco
et al., 1993; Sánchez et al., 2005) y
Bacillus sp. BP-7 (López et al., 1998). Estas
cepas fueron aisladas a partir de suelo de
arrozal del Delta de L'Ebre (lugar rico en
materia vegetal en descomposición y por tanto
adecuado para aislar degradadores de celulosa
y xilano), mediante cultivos de
enriquecimiento en paja de arroz. Estas cepas
presentaban elevada actividad degradadora de
xilano, celulosa, pectina, tributirina y aceite de
oliva.
En los experimentos de clonación se usaron las
siguientes cepas huéspedes:
- Bacillus subtilis MW15 (Wolf et al.,
1995): es una cepa deficiente en las
proteasas neutra y alcalina, en una celulasa,
una lichenasa y una xilanasa. his nprR2
nprE18 ΔaprA3 ΔeglS102 ΔbglT-bglSRV
ΔxynA CmR.
- Bacillus subtilis MB216 (Lampen et al.,
1986): Stp leuA8 arg-15 thrA recE4 hsrR
hsrM.
- Escherichia coli 5K (Godessart et al.,
- - -
1988): F rk mk rpsL thr thi leu lacZ.
- Escherichia coli HB101 (Bolivar y MM.2.2.
Backman, 1979): supE44 hsd20 rb- mb-
recA56 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20
xyl-5 mtl-1.
35
- Escherichia coli XL1-Blue (Bullock et al.,
1987): recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
supE44 relA1 lac [F′proAB lacIqZ∆M15
Tn10 (Tetr)].
- Escherichia coli DH5α (Hanahan, 1983):
F- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169
deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA
supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1.
- Escherichia coli BL21(DE3) (Studier y
Moffatt, 1986): contiene el lisógeno λDE3
en su cromosoma, por lo que es capaz de
expresar la ARN polimerasa de T7 al
añadirse al medio de cultivo IPTG. hsdS
gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7).
- Saccharomyces cerevisiae BY4741
(Andrés, 2003): MATa ura3Δ0 leu2Δ0
met15Δ0 his3Δ1.
- Saccharomyces cerevisiae mnn9
(Hernández et al., 1989): cepa deficiente en
glicosilación. MATa ura3Δ0 leu2Δ0
met15Δ0 his3Δ1 ypl050c::kanMX4.
2. CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE
MICROORGANISMOS
2.1. Medios de cultivo
Los medios de cultivo más comúnmente
utilizados se describen en las Tablas MM.2.1 y
En el caso de medios sólidos, al medio líquido
correspondiente se añadía agar al 1,5%.
36

Tabla MM.2.1: Preparación de los medios de cultivo bacterianos comúnmente utilizados.

Composición por litro Preparación
LB (Luria Broth) Bactotriptona 10 g Tras disolver se llevaba a pH 7 y se
Extracto de levadura 5g esterilizaba en autoclave.
NaCl 10 g
Agua destilada
Caldo nutritivo Extracto de carne 1g Tras disolver se llevaba a pH 7 y se
Extracto de levadura 2g esterilizaba en autoclave.
Peptona 5g
NaCl 5g
Agua destilada
BREC1 NH4Cl 8g Se disolvían los 5 primeros
(Overbeeke et al., KH2PO4 4g componentes en agua y se autoclavaba.
1990) MgSO4·7H2O 1g Se autoclavaba el extracto de levadura
Sacarosa 40 g aparte, y se mezclaba todo antes de
NaCl 2g usar.
Extracto de levadura 10 g
Agua bidestilada
Solución traza 1 ml
Solución de vitaminas 1 ml
Solución traza para Tritriplex III (EDTA) 45 g Se disolvía el tritriplex llevando la
medio BREC1 CaCl2 95% 4,37 g solución a pH 8. Se añadían el resto de
FeSO4·7H2O 3,75 g componentes previamente diluidos y se
MnSO4·H2O 1,4 g esterilizaba en autoclave.
ZnSO4·7H2O 2,2 g
CuSO4·5H2O 0,4 g
CoCl2·6H2O 0,45 g
Na2MoO4·2H2O 0,26 g
H3BO3 0,4 g
KI 0,26 g
Agua destilada
Solución de Biotina 0,05 g Se disolvía y se esterilizaba por
vitaminas para Tiamina 5g filtración.
medio BREC1 Meso-inositol 4,7 g
Clorhidrato de piridoxina 1,46 g
Ácido D-pantoténico 23 g
Agua destilada
MG (NH4)2SO4 2g Se disolvían las sales de manera
K2HPO4 14 g secuencial en agua destilada. Para
KH2PO4 6g medios sólidos se disolvía el agar en
Citrato de sodio 1g agua destilada aparte. Se autoclavaban
MgSO4·7H2O 0,2 g por separado, se mezclaba a 50 ºC y se
Glucosa 50% 10 ml añadía la glucosa, la histidina y los
Histidina al 0.5% 10 ml casaminoácidos, previamente
Casaminoácidos al 5% 4 ml esterilizados.
MG2 (NH4)2SO4 2g Se disolvían las sales de manera
K2HPO4 14 g secuencial en agua destilada. En el caso
KH2PO4 6g de preparar medios sólidos se disolvía
Citrato de sodio 1g el agar en agua destilada aparte.
MgSO4·7H2O 0,2 g Se autoclavaban por separado, se
Sacarosa 5g mezclaban a 50 ºC y se añadía la
Histidina al 0,5% 10 ml histidina y los casaminoácidos,
Casaminoácidos al 5% 4 ml previamente esterilizados.
 37

Tabla MM.2.2: Preparación de los medios de cultivo de levaduras utilizados.

Composición por litro Preparación
YPD Bactotriptona 20 g Tras disolver se llevaba a pH 7 y se
Extracto de levadura 10 g esterilizaba en autoclave.
Glucosa 20 g
Agua destilada
SD (medio mínimo Base nitrogenada para levaduras Tras disolver se llevaba a pH 6 y se
sintético para (sin aminoácidos) 7g esterilizaba en autoclave.
levaduras) Glucosa 20 g Antes de utilizar se añadían los
Sulfato amónico 5g aminoácidos y nucleótidos necesarios
Agua bidestilada (a concentraciones finales entre 0,002%
y 0,008%).

Cuando el experimento lo requería los medios etanol absoluto. La concentración final de

se suplementaban con diferentes sustratos, a uso era de 5 - 50 µg/ml.
las concentraciones finales indicadas: xilano
de madera de abedul (0,2 - 0,4%), xilano de En ocasiones, para la selección de cepas
espelta de avena (1%), xilano-RBB (0,1%), recombinantes de E. coli XL1-Blue y E. coli
paja de arroz (1%), ácido poligalacturónico DH5α, se usaron medios de cultivo
(0,4%), CMC (Carboximetil Celulosa; 0,5%), suplementados con IPTG (isopropil-β-
tributirina o aceite de oliva (1%). tiogalactopiranósido) y X-gal (5-bromo-4-
cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido):
Cuando era necesario se añadían antibióticos a - IPTG: se utilizaba como inductor de ls
los medios de cultivo: expresión génica. Se preparó una solución
- Ampicilina: se preparó una solución concentrada de IPTG 20 mg/ml en agua
concentrada de ampicilina 100 mg/ml en bidestilada y se esterilizó por filtración. La
agua bidestilada a la que se añadió NaOH concentración final de uso era de
hasta la completa solubilización de la 100 µg/ml.
ampicilina, y se esterilizó por filtración. La - X-gal: sustrato cromogénico de la
concentración final de uso en el medio era β-galactosidasa. Se preparó una solución
de 50 ó 100 µg/ml. concentrada de X-gal 200 mg/ml en
- Tetraciclina: se preparó una solución dimetilformamida. La concentración final
concentrada de tetraciclina 12,5 mg/ml en los medios era de 40 µg/ml.
etanol al 50%, y se esterilizó por filtración.
La concentración final en los medios era de Cuando se cultivaban en medio mínimo SD las
15 µg/ml. cepas S. cerevisiae BY4741 y S. cerevisiae
- Cloramfenicol: se preparó una solución mnn9 sin haber sido transformadas con
concentrada de cloramfenicol 100 mg/ml en plásmidos recombinantes que compensasen
38
sus auxotrofías, se suplementaba el medio con
los siguientes aminoácidos y nucleótidos:
– Histidina 0,0080%.
– Leucina 0,0020%.
– Uracilo 0,0035%.
– Adenina 0,0020%.
2.2. Mantenimiento de cepas
Las cepas de Bacillus y Paenibacillus se
mantenían a 4 ºC resembrándolas cada 15 días
en placas de Agar Nutritivo (suplementado con
los antibióticos necesarios), las cuales se
incubaban a 30 ºC durante unas 16 - 24 h.
Las cepas de E. coli se mantenían también a
4 ºC resembrándolas cada 30 días en placas de
Agar LB (suplementado con los antibióticos
necesarios), las cuales se incubaban a 37 ºC
durante unas 16 - 24 h.
Asimismo, todas las cepas se mantenían
también congeladas a -80 ºC en glicerol al
15 %.
2.3. Fraccionamiento celular
2.3.1. Sonicación
Fue el método habitual para pequeños
volúmenes de cultivo.
Las muestras de cultivos líquidos (5 - 10 ml)
de toda la noche de las cepas a estudiar, tras
medir su D.O.600nm, se centrifugaban para
sedimentar las células, usando para ello una
centrífuga de sobremesa, a 3000 r.p.m. durante
15 min a 4 ºC.
Se recuperaba los sobrenadantes (medio de
cultivo) en tubos aparte. Los pellets de células
se resuspendían en 1 ml de Ringer 1/4 para
lavar las células, se transferían a tubos
eppendorf, y se centrifugaban en una
centrífuga eppendorf a 14000 r.p.m. durante
10 min a 4 ºC para sedimentar nuevamente las
células, descartando el sobrenadante.
Para obtener los extractos celulares, las células
se resuspendían en 1/10 del volumen original
de tampón Tris-HCl 100 mM pH 7 y se lisaban
por sonicación mediante 2 pulsos de 2 min a
50 W. Después de sonicar no se centrifugaba,
de manera que los extractos obtenidos
contenían tanto el citoplasma celular como los
restos de membrana y pared bacterianas.
2.3.2. French Press
Fue el método habitual para grandes
volúmenes de cultivo.
Se repartían los cultivos líquidos (1 - 2 l) de
toda la noche de las cepas a estudiar en tubos
Beckman de 450 ml, y tras medir la D.O.600nm
se centrifugaba para sedimentar las células,
usando para ello una centrífuga Beckman
high-speed, a 7000 r.p.m. durante 15 min a
4 ºC.
Se recuperaban los sobrenadantes (medio de
cultivo) en tubos aparte. Para lavar las células,
los pellets se resuspendían en 50 ml de
Ringer 1/4 o tampón a pH 7, se transferían a
tubos Beckman de 35 ml, y se centrifugaba en
 39

una centrífuga Beckman high-speed a 3. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

7000 r.p.m. durante 15 min a 4 ºC para
sedimentar las células, descartando el 3.1. Determinación de actividad
sobrenadante.
hidrolítica sobre polisacáridos
Para obtener los extractos celulares, las células
mediante el método de
se resuspendían en 50 ml de tampón a pH 7 y
se lisaban por presión, utilizando un aparato de Nelson-Somogyi
French Press, en el que se sometían las células Este método permite cuantificar azúcares
bacterianas a presiones de 1000 psi reductores (extremos reductores), con lo que
(6894,76 kPa). permite valorar la actividad de enzimas
hidrolíticas que rompen polisacáridos
Después de lisar las células, se centrifugaba en generando nuevos extremos reductores, como
una centrífuga Beckman high-speed a es el caso de xilanasas, celulasas, pectinasas,
10000 r.p.m. durante 30 min a 4 ºC para amilasas, liquenasas (Spiro, 1966).
sedimentar las células no lisadas y la mayor Fue el método principalmente utilizado para
parte de restos celulares particulados, que se determinar las actividades enzimáticas que se
descartaban. Los sobrenadantes resultantes indican en la Tabla MM.3.3.
eran extractos celulares que contenían
Tabla MM.3.3: Actividades enzimáticas
básicamente la fracción citoplasmática.
ensayadas mediante el método de Nelso-Somogyi.

Actividad Polisacáridos utilizados

2.3.3. Lisis celular seguida de enzimática como sustrato en el ensayo
ultracentrifugación Xilanasa Principalmente xilano de
madera de abedul, aunque
Fue el método utilizado para la obtención de
también otros, como el xilano
fracciones celulares solubles desprovistas de de espelta de avena y
arabinoxilanos.
membranas.
Celulasa Carboximetil Celulosa y
Avicel
Partiendo de extractos celulares obtenidos por Pectinasa Pectina y ácido
cualquiera de los métodos anteriores, se poligalacturónico
repartían en tubos Beckman de 8 ml, y se Amilasa Almidón

centrifugaban usando una ultracentrífuga Liquenasa Liquenano

Laminarinasa Laminarina
Beckman a 38000xg durante 1 h a 4 ºC.

Para valorar la actividad hidrolítica sobre un

determinado polisacárido, las muestras
40

(5 - 25 µl) se incubaban con una solución de La valoración de la actividad se hacía frente a

dicho polisacárido a una concentración final una recta patrón del monosacárido que
del 0,5% en el tampón apropiado para obtener constituía el polisacárido sobre el que se
el pH deseado, y a la temperatura adecuada evaluaba la actividad hidrolítica, preparado en
para cada enzima. El volumen final de las mismas condiciones que en el ensayo de
reacción era de 100 μl. actividad. Una unidad de actividad enzimática
Por cada muestra se incubaban 3 tubos se define como la cantidad de enzima que
eppendorf: 2 réplicas y un blanco (al cual la libera 1 μmol de azúcar reductor por minuto en
muestra se añadía tras el reactivo de cobre). las condiciones de ensayo.
Después de la incubación a una temperatura
adecuada para las enzimas a ensayar, durante Soluciones:
el tiempo necesario, se enfriaban los tubos en - Reactivo alcalino de cobre:
hielo durante 5 min y se añadía agua Solución I: Tartrato sódico potásico 15 g
(1 litro) Na2CO3 30 g
bidestilada hasta 250 µl. NaHCO3 20 g
A continuación se añadían 250 µl de reactivo Na2SO4 180 g
de cobre (el cual se preparaba inmediatamente
Para preparar la Solución I se disolvían
antes de usar mezclando Solución I y
primero el tartrato sódico potásico y el Na2CO3
Solución II en una proporción 4:1 en
en agua bidestilada; y después se añadían el
volumen). Se mezclaba mediante vortex y se
NaHCO3 y el Na2SO4 ya disuelto en agua
calentaba al baño maría (a 100 ºC) durante
bidestilada.
10 min. Esto permitía que se diera la reducción
del Cu2+ en función de las sustancias
Solución II: CuSO4·5H2O 5g
reductoras del medio. (250 ml) Na2SO4 45 g
Tras enfriar en agua, se añadían 250 µl de
reactivo de arsenomolibdato (preparado Para preparar la Solución II se disolvían los

previamente a partir de una solución de dos reactivos en agua bidestilada.

arsenomolibdato y una de H2SO4 1,5 N en una

proporción 1:2 en volumen). Se mezclaba - Reactivo de arsenomolibdato:

usando vortex y se añadían 750 μl de agua Solución de (NH4)6Mo7O24·4H2O 25 g

arsenomolibdato: H2SO4 96% 21 ml
bidestilada (volumen final de 1,5 ml). (500 ml) Na2HAsO4·7H2O 3g
Por último, se centrifugaba durante 5 min a NaHCO3 20 g

4 ºC para precipitar sólidos y evitar así

Para preparar esta solución, se disolvía el
interferencias en la lectura espectrofotométrica
(NH4)6Mo7O24·4H2O en agua bidestilada, se
de la absorbancia de los sobrenadantes a
añadía el H2SO4 al 96%, se agitaba y se añadía
520 nm.

a continuación el Na2HAsO4·7H2O
previamente disuelto en agua bidestilada. Por
último, se incubaba a 37 ºC durante 24 - 48 h y
se guardaba en una botella opaca para
protegerla de la luz.
3.2. Ensayo cromogénico de
actividad xilanasa
El método utilizado es una modificación del
método descrito por Biely et al. (1998).
En este método se utiliza como sustrato de la
reacción el xilano-RBB (xilano-Remazol
Brilliant Blue), un xilano marcado con el
cromógeno Remazol Brilliant Blue R. Cuando
este sustrato es degradado por endoxilanasas y
se añade etanol precipitan los fragmentos de
alto peso molecular, mientras los fragmentos
de menor peso molecular liberados por el
enzima quedan en solución, pudiéndose medir
fotométricamente el color solubilizado.
Las ventajas respecto a los métodos basados
en la liberación de azúcares reductores son:
- No se ve interferido por sustancias
reductoras del medio.
- Es específico para endoxilanasas: las
enzimas de tipo exo no interfieren ni
producen falsos positivos.
Y las desventajas son:
- Es aproximadamente seis veces menos
sensible que el método de Nelson-Somogyi.
- El marcaje del xilano no puede ser
controlado de manera precisa, de manera
41
que cada lote de xilano-RBB ha de ser
estandarizado antes de utililizarse.
Para valorar la actividad xilanasa se incubaban
las muestras (50 - 125 µl) con xilano-RBB
(Sigma, 16% de marcaje) a una concentración
final del 5,92 mg/ml (equivalente a 0,5% de
xilano no marcado), en el tampón apropiado
para obtener el pH deseado, a la temperatura
adecuada y durante el tiempo necesario, en un
volumen final de 0,5 ml.
Por cada muestra se incubaban 3 tubos
eppendorf: 2 réplicas y un blanco.
Después de la incubación se añadía 1 ml
(2 volúmenes) de etanol absoluto y se
mezclaba. El etanol detenía la reacción y hacía
precipitar el sustrato no hidrolizado y los
fragmentos de alto peso molecular.
En este punto se añadía también la muestra al
blanco.
A continuación se mantenía 30 min a
temperatura ambiente (equilibración térmica
de las muestras), tras los cuales se centrifugaba
a 2000xg durante 3 min, y se recuperaba el
sobrenadante, sobre el cual se hacía la medida
de absorbancia a 595 nm (D.O.595).
La valoración de la actividad se hacía frente a
una recta patrón elaborada midiendo la D.O.595
de ensayos con concentraciones crecientes del
enzima en las mismas condiciones y
correlacionando los valores obtenidos con
cuantificaciones obtenidas mediante el método
Nelson-Somogyi de las mismas
concentraciones de enzima.
42

3.3. Ensayo de actividad sobre concentración final de 5 mg/ml (para los

aril derivados ensayos de especificidad de sustrato), 5 mM

(para los ensayos de actividad rutinarios) o
Se utilizó un método fotométrico basado en el
variable (para los ensayos de cinética
uso de aril derivados como sustratos. Los aril
enzimática), en el tampón apropiado para
derivados utilizados en los ensayos del
obtener el pH deseado, en un volumen final de
presente trabajo, adquiridos a Sigma-Aldrich,
0,25 ml, y a una temperatura adecuada para
se recogen en la Tabla MM.3.4.
cada enzima.
Tabla MM.3.4: Aril derivados y su abreviatura. Por cada muestra se incubaban 3 tubos
eppendorf: 2 réplicas y un blanco (al cual la
Aril derivado Abreviatura
pNitrofenil-β-D-Xilopiranósido pNPX muestra se añadía tras parar la reacción).
oNitrofenil-β-D-Xilopiranósido oNPX Después de incubar, los tubos se mantenían en
pNitrofenil-β-D-Glucopiranósido pNPG
hielo durante 5 min, y a continuación se añadía
pNitrofenil-β-Celobiósido pNPG2
pNitrofenil-β-Celotriósido pNPG3 1 ml de Na2CO3 1 M a cada tubo para parar la
pNitrofenil-β-Celotetraósido pNPG4 reacción.
pNitrofenil-β-Celopentaósido pNPG5
Por último, se medía la absorbancia a 400 nm
pNitrofenil-α-L-Arabinopiranósido pNAp
pNitrofenil-α-L-Arabinofuranósido pNAf (D.O.400nm) en un espectrofotómetro.

La valoración de la actividad se hacía frente a

Estos aril derivados eran prácticamente
una recta patrón de paranitrofenol u
incoloros y estaban formados por un
ortonitrofenol (dependiendo del grupo arilo
sustituyente carbohidratado (por ejemplo
presente en el aril derivado utilizado)
xilosa o glucosa) unido a un grupo arilo
preparada en las mismas condiciones.
(paranitrofenol, pNP, u ortonitrofenol, oNP),
simulando ser sustratos diméricos u
En los experimentos de cinética enzimática y
oligómeros cortos. La ruptura enzimática del
de termoestabilidad, se sustituyó el ensayo en
enlace entre el sustituyente y el grupo arilo,
tubo eppendorf por un ensayo en placas de
permite la liberación de este este último en
microtiter de 96 pocillos, que permiten realizar
forma soluble, la cual presenta coloración
un mayor número de ensayos simultáneos. En
amarilla que puede ser cuantificada
estos casos, el volumen final por pocillo era de
fotométricamente.
0,2 ml, y no se paraba la reacción con Na2CO3,
realizándose la lectura de absorbancia en el
Para valorar la actividad de las enzimas sobre
lector de placas inmediatamente tras la
estos sustratos, se incubaban las muestras
incubación.
(5 - 50 µl) con el aril derivado a una
 43

3.4. Determinación del pH óptimo La MDH cataliza la siguiente reacción

enzimática:
Para determinar el pH óptimo (pH al que una
enzima tiene máxima actividad), se hicieron Oxalacetato + NADH + H+ ↔ Malato + NAD+
los ensayos de actividad enzimática, sobre los
sustratos adecuados, a diferentes pH en En nuestros experimentos, se cuantificó la
intrrvalos de 0,5 puntos de pH, usando para conversión de NADH + H+ a NAD+ midiendo
ello soluciones tampón distintas en función del la absorbancia a 334 nm (midiendo pues el
rango de pH a cubrir: decremento de NADH + H+).
Rango de pH
Tampón cubierto
A partir de cultivos líquidos se obtenían las
Citrato sódico 50 mM 3,0 - 4,0
Acetato sódico 50 mM 4,0 - 6,0 muestras a analizar: sobrenadantes de cultivo y
Fosfato sódico 50 mM 6,0 - 7,5 extractos celulares libres de restos celulares y
Tris-HCl 50 mM 7,0 - 9,0 membranas.
Glicina sódica 50 mM 9,0 - 12,0
La reacción enzimática se realizaba en una
cubeta espectrofotométrica de cuarzo, en la
3.5. Determinación de la que se mezclaban 1 ml de tampón fosfato
temperatura óptima potásico 200 mM pH 7,8, la muestra (máximo
1,2 ml), agua bidestilada esterilizada hasta
Para determinar la temperatura óptima
2,2 ml y 100 μl de NADH 6 mM.
(temperatura a la que una enzima muestra
A continuación se hacía el blanco de
máxima actividad), se hicieron los ensayos de
absorbancia a 334 nm, se añadían 100 μl de
actividad enzimática, sobre los sustratos
oxalacetato potásico 14 mM, se mezclaba por
adecuados, en amplio rango de temperaturas
inversión y se hacía un seguimiento del
en intervalos de 5 ó 10 ºC.
decremento de absorbancia a 334 nm durante
6 min a temperatura ambiente.
3.6. Cuantificación de la actividad Además se hacía un control de oxidación del

malato deshidrogenasa NADH, sin muestra.

La malato deshidrogenasa (MDH) es una Las unidades de actividad MDH (mol/min) se

enzima intracelular del ciclo de Krebs, que por calculaban a partir de la pendiente de la recta
tanto sólo se detecta en sobrenadantes de resultante y en función del coeficiente de
cultivos bacterianos si existe lisis celular, de extinción molar del NADH a 334 nm
manera que puede utilizarse como marcador (6,11·103 M-1cm-1) según la siguiente fórmula:
para cuantificar el porcentaje de lisis celular en    D.O.334nm Muestra− D.O.334nm Control ×Volumen

U= Coeficiente extinción molar ×1cm 

Bacillus subtilis. tiempo

44

El grado de lisis se expresó como el porcentaje midiendo la absorbancia a 340 nm (midiendo

de actividad malato deshidrogenasa pues el incremento de NADPH + H+).
extracelular (en sobrenadantes) respecto a la
actividad malato deshidrogenasa total (en A partir de cultivos líquidos se obtenían los
extractos celulares más sobrenadantes). sobrenadantes de cultivo y los extractos
celulares libres de restos celulares y
Soluciones: membranas.
Tampón K2HPO4 200 mM + KH2PO4 La reacción enzimática se realizaba en una
fosfato 200 mM hasta pH 7,8 cubeta espectrofotométrica de cuarzo, en la
potásico
200 mM que se mezclaban 500 μl de tampón fosfato
pH 7,8: potásico 100 mM pH 8, 20 μl de MgCl2
Oxalacetato Oxalacético 28 mM 25 ml 250 mM, 50 μl de NADP 8 mM, la muestra
potásico KOH 28 mM 25 ml
14 mM: (máximo 420 μl) y agua bidestilada
(50 ml) esterilizada hasta 990 μl.
NADH 6 mM A continuación se hacía el blanco de
absorbancia a 340 nm, se añadían 10 μl de
isocitrato 100 mM, se mezclaba por inversión
3.7. Cuantificación de la actividad
y se hacía un seguimiento del incremento de
isocitrato deshidrogenasa
absorbancia a 340 nm durante 6 min a
La isocitrato deshidrogenasa (ICDH) es una temperatura ambiente.
enzima intracelular del ciclo de Krebs, Además se hacía un control de reducción del
relativamente resistente a los exoenzimas de NADP, sin muestra.
Bacillus subtilis. Sólo se detecta en
sobrenadantes de cultivos bacterianos si existe Las unidades de actividad ICDH (mol/min) se
lisis celular, de manera que puede utilizarse calculaban a partir de la pendiente de la recta
como marcador para cuantificar el porcentaje resultante y en función del coeficiente de
de lisis celular (Harwood et al., 1990). extinción molar del NADPH a 340 nm
(6,22·102 M-1cm-1) según la siguiente fórmula:
La ICDH, en presencia de Mn2+ o Mg2+,    D.O.340nm Muestra− D.O.340nm Control ×Volumen

U=
Coeficiente extinción molar ×1cm 

cataliza la siguiente reacción enzimática: tiempo

threo-Ds isocitrato + NADP+ ↔ 2-oxoglutarato El grado de lisis se expresó como el porcentaje

+ NADPH + H+ + CO2 de actividad isocitrato deshidrogenasa

extracelular (en sobrenadantes) respecto a la
actividad malato deshidrogenasa total (en
En nuestros experimentos, se cuantificó la
extractos celulares más sobrenadantes).
conversión de NADP a NADPH + H+
 45

Soluciones: pET3b: este plásmido forma parte de la serie

Tampón fosfato K2HPO4 100 mM + de vectores pET (Studier y Moffatt, 1986;
potásico 100 mM KH2PO4 100 mM hasta Novagen) para la expresión inducible por
pH 8: pH 8
IPTG en cepas de E. coli que contengan el
Isocitrato 100 mM
lisógeno λDE3. El plásmido pET3b permite
NADP 8 mM
clonar genes bajo el control del promotor
fuerte e inducible del fago T7, entre las dianas
4. VECTORES PLASMÍDICOS UTILIZADOS NdeI y BamHI. Además posee un gen
marcador para la selección de transformantes
pUC19: el plásmido pUC19 (Yanisch-Perron
en ampicilina.
et al., 1985) es un vector de clonación en
pN5: el plásmido pN5 (Pastor et al., 1999) es
E. coli de alto número de copia, que permite la
un vector lanzadera E. coli - Bacillus subtilis,
selección blanco-azul de recombinantes
resultado de la ligación de pUC19 con pC194
gracias a que el polylinker (sitio de clonación
(vector de clonación en Bacillus subtilis)
múltiple) se encuentra interrumpiendo el gen
(Alonso y Tailor, 1987). Permite la selección
5'-lacZ. Las colonias transformantes pueden
de transformantes por resistencia a ampicilina
seleccionarse por su resistencia a ampicilina
(E. coli) y cloramfenicol (B. subtilis).
(gracias al gen bla del plásmido, que codifica
pRB473: el plásmido pRB473 (Obst et al.,
para una β-lactamasa).
1995) es un vector lanzadera
pGEM®-T y pGEM®-T easy: vectores
E. coli - Bacillus subtilis derivado de pBR322
comerciales de la empresa Promega
(vector de clonación en E. coli de bajo número
Corporation (Robles y Doers, 1994) basados
de copia) (Bolivar et al., 1977) y pUB110
en el plásmido pGEM®-5Zf(+) de clonación
(vector de clonación en B. subtilis) (Maciag et
en E. coli (Yanisch-Perron et al., 1985),
al., 1988). Permite la selección de
digerido con EcoRV (en posición 51 en el caso
transformantes por resistencia a ampicilina
de pGEM®-T, y 60 en el caso de
(E. coli) y cloramfenicol (B. subtilis).
pGEM®-T easy), al que se ha añadido una
pRBSPO2: el vector pRBSPO2 contiene el
timina (T) en cada extremo 3' libre, para
promotor SPO2, promotor fuerte en B. subtilis
aumentar la eficacia de clonación de
(Williams et al., 1981b; Bolhius et al., 1999),
fragmentos de ADN provenientes de
insertado en el polylinker de pRB473.
amplificación con polimerasas que añaden una
pMSR8: el plásmido pMSR8 (Soriano, 2004)
adenina en 3', como la Taq polimerasa.
es un vector lanzadera
Permiten la selección de transformantes por
E. coli - Bacillus subtilis derivado de pUC19 y
resistencia a ampicilina.
pUB110. Permite la selección de
46

transformantes por resistencia a ampicilina 15 min, se le añadían 500 µl de isopropanol, y

(E. coli) y kanamicina (B. subtilis). se dejaba 5 min a temperatura ambiente. Tras
pMSR8amy y pMSR8SPO2: son vectores este tiempo, se centrifugaba 5 min y se
derivados del vector pMSR8, que contienen decantaba el isopropanol. El pellet (que
los promotores de la α-amilasa (Palva et al., contenía el ADN) se secaba al vacío y se
1981) y SPO2, respectivamente, promotores resuspendía en 200 µl de TE.
fuertes en B. subtilis. A continuación se añadían 200 µl de LiCl 5 M
YEplac195: vector lanzadera y se mantenía la preparación 5 min a -20 ºC.
E. coli-S. cerevisiae (Gietz y Sugino, 1988). Se centrifugaba 5 min, y se recuperaba el
sobrenadante.
Para precipitar el ADN, se añadían 40 µl de
5. ANÁLISIS Y MANIPULACIÓN DEL solución III y 2 volúmenes de etanol absoluto
ADN RECOMBINANTE frío, y se dejaba 1 h a -20 ºC. Después el ADN
se recogía por centrifugación (15 min), se
5.1. Extracción de ADN lavaba 2 veces con etanol al 70% frío
(1 volumen de etanol), se secaba al vacío y se
plasmídico
resuspendía en el volumen adecuado de agua
5.1.1. Minipreparación de ADN bidestilada esterilizada.
plasmídico por lisis alcalina
Soluciones:
A partir de 5 - 10 ml de cultivos en fase
estacionaria, las células se recogían por Solución I: Glucosa 50 mM.
Tris-HCl 25 mM pH 8.
centrifugación y se resuspendían en 200 µl de EDTA 10 mM.
solución I agitando vigorosamente. En caso de Solución II: NaOH 0,2 N.
extraer ADN plasmídico de Bacillus subtilis, SDS 1%.
se añadían también 20 µl de lisozima Solución III: Acetato sódico 3 M.
Ajustada a pH 4,8 con ácido
20 mg/ml (concentración final de 2 mg/ml), acético glacial.
para degradar su gruesa pared celular de TE: Tris-HCl 10 mM pH 8.
peptidoglicano. Se incubaba con la solución I EDTA 1 mM.
durante 5 min en hielo.
Se añadían a continuación 400 µl de
5.1.2. Midipreparación de ADN
solución II y se mantenía 5 min en hielo.
plasmídico
Después se añadían 300 µl de solución III y se
Se utilizó el kit comercial QIAGEN-tip 100
mantenía otros 5 min en hielo.
MidiPrep.
El sobrenadante se recuperaba tras centrifugar
en una microcentrífuga eppendorf durante
 47

En este kit, el ADN plasmídico se aislaba Este tratamiento solo se aplicó a las muestras
mediante cromatografía de intercambio de ADN plasmídico cuando el ARN podía
aniónico en columna, partiendo de 25 ml de enmascarar la presencia de algunos fragmentos
cultivo para plásmidos de alto número de de ADN en los geles. Por el contrario, no se
copia (como pUC19), y de 100 ml de cultivo aplicó a las muestras obtenidas usando el kit
para plásmidos de bajo número de copia comercial QIAGEN-tip 100 MidiPrep, ya que
(como pRB473). en su protocolo se incluye un tratamiento con
RNAsa A.

5.2. Digestión con enzimas de

restricción y tratamiento con 5.3. Ligación de moléculas de
RNAsa ADN
Las ligaciones entre insertos y vectores de
5.2.1. Digestión con enzimas de ADN se realizaron usando la ligasa del
restricción bacteriófago T4 (Biolabs) siguiendo las
Las digestiones con enzimas de restricción se instrucciones de la casa comercial.
hicieron siguiendo las instrucciones del Generalmente, las proporciones molares entre
suministrador (Boehringer Mannheim, ADN vector y ADN inserto fueron 1:3 cuando
Promega o Biolabs). se trabajaba con plásmidos de clonación en
Los tampones utilizados fueron los E. coli y 1:6 cuando se trabajaba con vectores
suministrados con cada enzima (los óptimos lanzadera E. coli - Bacillus subtilis.
según la casa comercial). En las digestiones
dobles se escogió el tampón más adecuado
para la actividad de ambas enzimas. 5.4. Amplificación por PCR

5.4.1. Amplificación de alta fidelidad

5.2.1. Tratamiento con RNAsa
La eliminación de ARN de las preparaciones
de ADN se realizó justo antes de cargar las
muestras en geles de agarosa mediante la
adición de RNAsa A (Biolabs) en una
concentración final de 10 µg/ml (a partir de un
stock de 5 mg/ml) e incubando a temperatura
ambiente durante 5 - 10 min.
Las amplificaciones preparativas, en las que
interesaba que no se introdujeran cambios
aleatorios en la secuencia de nucleótidos, se
llevaron a cabo utilizando una ADN
polimerasa de alta fidelidad (Stratagene cloned
Pfu ADN Polymerase) para la reacción de
amplificación, siguiendo las instrucciones de
la casa comercial:
48

Tampón 10X: 1X Tampón 10X: 1X

Deoxinucleótidos Deoxinucleótidos
200 μM cada dNTP 200 μM cada dNTP
trifosfato (dNTPs): trifosfato (dNTPs):
ADN molde: 50 - 200 ng/100 μl Dideoxinucleótido
200 μM extra
Cebadores: 0,2 μM cada uno trifosfato en exceso:
Polimerasa Pfu: 5,0 U/100 μl ADN molde: 50 - 200 ng/100 μl
Cebadores: 0,4 μM cada uno
Polimerasa Taq: 2,5 U/100 μl
Generalmente los volúmenes de reacción eran
de 50 μl, aunque en algunas ocasiones se
Generalmente los volúmenes de reacción eran
usaron volúmenes de 100 μl para obtener
de 50 μl; y tras la amplificación se mezclaba el
mayor cantidad de ADN amplificado.
contenido de los 4 tubos utilizados.

El termociclador utilizado fue un Perkin Elmer

El termociclador utilizado fue un Perkin Elmer
GeneAmp PCR System 2400.
GeneAmp PCR System 2400.

El ADN amplificado se purificó usando el kit

Wizard® de Promega para la eliminación de 5.5. Gene Shuffling
sales, cebadores, dNTPs y otros (recombinación in vitro por PCR)
contaminantes.
Se utilizó un método muy similar al de
Stemmer (1994), consistente básicamente en
5.4.2. PCR mutagénica fragmentar las diferentes copias de un gen o

Permite realizar mutagénesis aleatoria fragmento de ADN de manera aleatoria con

aprovechando la falta de actividad correctora DNAsa I, para después volver a recomponer el

de polimerasas como la Taq. gen mediante una primera PCR sin cebadores

Además, para aumentar la tasa de error de esta (PCR I), que permite la mezcla aleatoria pero

ADN polimerasa (2x10-5 mutaciones por ordenada de los diferentes fragmentos (con o

nucleótido por ciclo), se realizaron 4 PCRs de sin mutaciones), y una segunda PCR de

amplificación diferentes del mismo gen, en amplificación utilizando 2 cebadores (PCR II),

cada una de las cuales uno de los cuatro que permite obtener la gran variedad de copias

dNTPs estaba en exceso. del gen generadas durante el proceso.

Para la reacción de PCR se siguieron las Se partía de amplificados obtenidos bien

instrucciones de la casa comercial mediante una PCR mutagénica bien mediante

suministradora de la Taq polimerasa: una PCR no mutagénica, pero utilizando en

ambos casos una ADN polimerasa sin
actividad correctora. Los amplificados eran
 49

analizados en geles de agarosa de bajo punto QIAGEN, y se comprobaba su tamaño por

de fusión (0,7% de agarosa en TAE), y la electroforesis en geles de agarosa 0,7% en
banda correspondiente al gen de interés se TBE.
eluía utilizando el kit Wizard® de Promega.
Una vez comprobado el tamaño de los
A continuación las muestras de ADN se fragmentos A y B de ADN, se realizaba con
sometían a una digestión parcial con DNAsa I ellos una PCR sin cebadores (PCR I), en la que
en presencia de Mg2+, para obtener fragmentos los mismos fragmentos de ADN actuaban
cohesivos de tamaño aleatorio. La mezcla de simultáneamente como molde y como
reacción contenía: cebadores, de manera que por
ADN muestra: 80 μl complementariedad de bases y amplificación,
Tampón Tris-HCl 1 M pH 7,4: 5 μl el gen se iba reensamblando de nuevo.
MgCl2 2,5 M: 4 μl
DNAsa I 1 U/μl: 1 μl Para encontrar las condiciones adecuadas de
Agua destilada: Hasta 100 μl PCR I para cada experimento de gene
shuffling, se realizaban varias PCR de prueba
Se incubaba a 25 ºC hasta obtener fragmentos
en 25 μl de reacción conteniendo diferentes
de ADN entre 150 y 500 bp. Para comprobar
cantidades (entre 10 y 17 μl) de fragmentos de
el tamaño de los fragmentos de digestión, cada
ADN de tipo A, de tipo B o una mezcla de
3 min se analizaban 3 μl de la mezcla de
ambos:
reacción mediante electroforesis en geles de
Tampón 10X: 1X
agarosa. Deoxinucleótidos
200 μM cada dNTP
Una vez los fragmentos de ADN alcanzaban el trifosfato (dNTPs):
ADN molde: 10 - 17 μl
rango de tamaño deseado, se paraba la Cebadores: -
reacción añadiendo 10 μl de EDTA 0,5 M y Polimerasa Taq: 2,5 U/100 μl
calentando a 80 ºC durante 10 min para
El programa de PCR utilizado se dividía en 2
inactivar la DNAsa I.
secciones para favorecer el aumento de tamaño
A continuación, las muestra de ADN digerido
de los fragmentos de ADN y permitir tomar
eran separadas en geles de agarosa de bajo
muestra a medio programa (tras los 20
punto de fusión (1,5% de agarosa en TAE), de
primeros ciclos) y monitorizar el aumento de
los que se recortaba por un lado la zona del gel
tamaño:
que contenía fragmentos de ADN de 200 a
400 bp (fragmentos de tipo A) y por otro la
que contenía fragmentos de 80 a 200 bp
(fragmentos de tipo B). Estos fragmentos de
ADN se eluían utilizando el kit QIAquick de
50

Hold Incial: 94 ºC 5 min Hold Inicial: 94 ºC 5 min

Desnaturalización: 94 ºC 30 s Desnaturalización: 94 ºC 30 s
x10-15
Hibridación: 50 ºC 30 s x20 ciclos Hibridación: 55 ºC 25 s
ciclos
Síntesis: 72 ºC 40 s Síntesis: 72 ºC 2 min
Hold Intermedio: 94 ºC 5 min Hold de síntesis: 72 ºC 10 min
Desnaturalización: 94 ºC 30 s Parada: 4 ºC -
Hibridación: 60 ºC 25 s x25 ciclos
Síntesis: 72 ºC 1 min Una vez concluido el programa de
Hold de síntesis: 72 ºC 10 min
Parada: 4 ºC - amplificación, los productos de PCR II se
analizaban electroforéticamente para
Una vez concluido el programa de comprobar el tamaño de los fragmentos
amplificación, los productos de cada PCR I amplificados y la obtención de un amplificado
eran analizados electroforéticamente para con el tamaño del fragmento original,
comprobar si había habido aumento de tamaño indicativo de que se había reconstruido dicho
de los fragmentos de ADN. fragmento.
Si era así, se usaban éstos como molde para la Si era así, se repetía la PCR II tantas veces
PCR II. como fuera necesario, y usando mayores
volúmenes de reacción, para obtener suficiente
En la PCR II se amplificaba el resultado de cantidad de ADN mutagenizado.
PCR I utilizando cebadores externos (los
mismos que se utilizaban en la amplificación La banda de ADN correspondiente al tamaño
previa al gene shuffling), con el objetivo de del gen mutagenizado se eluía utilizando el kit
obtener múltiples copias de las diferentes Wizard® de Promega tras su separación en
variantes mutagenizadas del gen original que geles de agarosa de bajo punto de fusión (0,7%
se hubieran generado durante el proceso: de agarosa en TAE).
Tampón 10X: 1X
Deoxinucleótidos Tampones:
200 μM cada dNTP
trifosfato (dNTPs):
Producto de PCR I: 1 μl TAE (10X): Tris 0,9 M
Cebadores: 0,4 μM cada uno Ácido acético 0,9 M
Polimerasa Taq: 2,5 U/100 μl EDTA 0,02 M
pH 8,3
El volumen utilizado era de 25 μl, y el
programa presentaba un número reducido de
ciclos para evitar la aparición de amplificados
inespecíficos:
 51

5.6. Transformación Después se añadía 1 ml de medio LB (sin

antibióticos) y se incubaba a 37 ºC durante 1 h
5.6.1. Transformación de Escherichia en agitación, para permitir la expresión de los
coli genes marcadores de resistencia a antibióticos
Se utilizó un método basado en el descrito por presentes en el ADN introducido.
Cohen et al. (1972).
Por último, las células transformadas se
A partir de un cultivo nocturno de la cepa de sembraban en placas de Agar LB
E. coli a transformar, se inoculaban 20 ml de suplementado con los antibióticos necesarios
LB fresco (con los antibióticos necesarios) y para la selección de transformantes y se
se incubaba a 37 ºC en agitación hasta una incubaban a 37 ºC durante 16 - 24 h.
D.O.600nm de 0,3 - 0,5 (correspondiente a la fase
exponencial de crecimiento).
5.6.2. Transformación de Bacillus
Una vez alcanzada esta densidad óptica, se
subtilis
separaban 10 ml del cultivo (volumen inicial)
Se utilizó el método descrito por Cohen y
y se mantenían a 0 ºC durante 10 min. A
Chang (1979).
continuación, se recogían las células por
centrifugación en una centrífuga de sobremesa
A partir de un cultivo nocturno en caldo
(5 min a 4 ºC), se resuspendían en 5 ml (1/2
Penassay de la cepa de B. subtilis a
del volumen inicial) de CaCl2 50 mM enfriado
transformar, se inoculaban 65 ml de caldo
en hielo, y se mantenían durante 20 min en
Penassay fresco (con los antibióticos
hielo.
necesarios) y se incubaba a 37 ºC en agitación
Transcurrido este tiempo se recogían las
hasta una D.O.600nm de 0,5 - 0,6
células por centrifugación (3 min a 4 ºC), se
(correspondiente a la fase exponencial de
resuspendían en 665 µl (1/15 del volumen
crecimiento).
inicial) de CaCl2 50 mM enfriado en hielo y se
Se separaban entonces 50 ml de cultivo
mantenían en hielo durante 1 - 1,5 h, para
(volumen inicial) y se centrifugaban para
obtener así células competentes.
recoger las células, que eran después
resuspendidas en 5 ml (1/10 del volumen
A continuación, 100 µl de células competentes
inicial) de SMMP con lisozima 2 mg/ml. Esta
se mezclaban con el ADN a introducir por
suspensión se incubaba a 37 ºC durante 3 h, en
transformación y se mantenían en hielo
agitación muy suave, hasta que al microscopio
durante 1 h. Tras este tiempo las células eran
se observaba la formación de protoplastos.
sometidas a un choque térmico de 42 ºC
durante 2 min, y se volvían a poner en hielo.
52

A continuación, se recogían los protoplastos (2600xg 15 min).

por centrifugación (2600xg 15 min) y se Después de este lavado, los protoplastos se
resuspendían en 5 ml de SMMP para resuspendían suavemente en 5 ml (1/10 del
recogerlos de nuevo por centrifugación volumen original) de SMMP.

Tabla MM.5.5: Medios y tampones para la transformación de protoplastos de Bacillus subtilis.

Composición Preparación
Caldo Penassay 1X Extracto de levadura 1,5 g Tras disolver se esterilizaba en
(1 l): Extracto de carne 1,5 g autoclave.
Peptona 5g
Glucosa 1g
NaCl 3,5 g
K2HPO4 3,68 g
KH2PO4 1,32 g
Agua destilada
Caldo Penassay 4X Extracto de levadura 1,5 g Tras diolver se esterilizaba en
(250 ml): Extracto de carne 1,5 g autoclave.
Peptona 5g
Glucosa 1g
NaCl 3,5 g
K2HPO4 3,68 g
KH2PO4 1,32 g
Agua destilada
SMM 2X Sacarosa 171,15 g Tras disolución de sus
(500 ml): Maleato 2,32 g componentes, se ajustaba a pH 6,5
MgCl2 4,06 g con NaOH, se enrasaba a 500 ml
Agua bidestilada con agua bidestilada y se
autoclavaba.
SMMP: Volúmenes iguales de caldo Penassay 4X Se hacía la mezcla en condiciones
y SMM 2X. estériles.
PEG6000 al 40% PEG6000 (Polietilenglicol 6000) 50 ml Se disolvía el PEG en SMM 2X
en SMM: caliente. Tras autoclavar, se
enrasaba a 100 ml con agua
destilada estéril.
Agar DM3 Agar 8g Se esterilizaban por filtración la
(1 l): Extracto de levadura 10% 5g BSA y los casaminoácidos. El
K2HPO4 3,5 g MgCl2 y el succinato sódico se
KH2PO4 1,5 g autoclavaban por separado. El
Glucosa 5g resto de productos se autoclavaban
Agua destilada 375 ml juntos.
Antes de plaquear, se calentaban
las diferentes soluciones; se
Succinato sódico 1 M pH 7,3 500 ml mezclaban el succinato sódico, el
MgCl2 1 M 20 ml cloruro de magnesio, los
Casaminoácidos 5% 100 ml casaminoácidos y la BSA, y se
Seroalbúmina bovina (BSA) 2% 5 ml añadían a la botella que contenía
el resto de productos con el agar.
Stock de lisozima: 20 mg/ml de lisozima en agua bidestilada Se esterilizaba por filtración.
 53

Se mezclaban 0,5 ml de protoplastos en 6. SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DE

SMMP con 1,5 ml de Polietilenglicol 6000
SECUENCIA
(PEG6000) al 40% en SMM, 50 µl de TE,
50 µl de SMM 2X y el ADN a introducir por
6.1. Secuenciación
transformación (de 1 pg a 5 μg). Esta mezcla
se incubaba 5 min a temperatura ambiente, y a Se utilizó la secuenciación automática

continuación se añadían 5 ml de SMMP y se fluorescente por PCR, empleando para ello los

centrifugaba para recuperar los protoplastos kits de secuenciación comerciales de

(2600xg 10 min). Amershan y Perkin Elmer y los secuenciadores

Una vez recuperados los protoplastos, se ABI PRISM 377 ADN Sequencer y ABI

resuspendían en 1 ml de SMMP y se PRISM 3700 ADN Analyzer (Perkin Elmer)

incubaban a 30 ºC durante 1,5 h en agitación de los Serveis Cientificotècnics de la

suave, para permitir la expresión de los genes Universitat de Barcelona (UB).

marcadores de resistencia a antibióticos

presentes en el ADN introducido.
6.2. Análisis informático de
secuencias
Por último, los protoplastos transformados se
sembraban en placas de Agar DM3 Se realizaron búsquedas de homología tanto de
suplementado con los antibióticos necesarios secuencias de nucleótidos como de
para la selección de transformantes, y se aminoácidos usando los programas Blast del
incubaba a 30 ºC durante 2 - 3 días para NCBI (Altschul et al., 1997), Fasta3 del EBI
permitir que los protoplastos regeneraran la (Pearson, 1990) y Blast del SubtiList Web
pared y así como el crecimiento de los clones Server (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ ;
transformantes correspondientes. Moszer et al., 1995). Se utilizaron los servicios
Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/ ; Finn et al.,
Los medios de cultivo y los tampones 2006) y ProDom (http://prodom.prabi.fr/ ; Bru
utilizados para esta técnica de transformación et al., 2005) para la búsqueda de homologías
se describen en la Tabla MM.5.5. de secuencia con dominios de proteínas ya
conocidas.

Asimismo se realizaron alineamientos

múltiples de secuencias de proteínas usando
los programas ClustalX (Thompson et al.,
1997) y ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ ;
54

Thompson et al., 1994) en su versión 1.8. Los 7. DICROISMO CIRCULAR

árboles filogenéticos a partir de estos
El dicroismo circular (CD) es una técnica
alineamientos se generaron usando el
espectrofotométrica basada en la absorción
programa ClustalX y se visualizaron con el
diferencial de la luz polarizada circularmente a
programa TreeView (Page, 1996).
la derecha y a la izquierda. Todas las
macromoléculas presentan esta característica,
En la predicción de péptido señal se utilizaron
que puede ser utilizada para la caracterización
los programas SignalP v1.1
estructural de proteínas (Beychok, 1966;
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ;
Bulheller et al., 2007).
Nielsen et al., 1997, 1999) y PSort v6.4
(http://psort.nibb.ac.jp/ ; Nakai y Kanehisa,
Para medir el CD de las proteínas purificadas,
1991, 1992).
se utilizó un espectropolarímetro Jasco J-810
(JASCO Inc.) de los Serveis Cientificotècnics
Para la predicción de estructura secundaria se
de la Universitat de Barcelona (UB).
utilizaron los servicios on-line Jpred
(http://www.compbio.dundee.ac.uk/~www-
jpred/ ; Cuff y Barton, 2000) y SCRATCH 8. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO
(http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/ ; Cheng
et al., 2005), ambos basados en el 8.1. Electroforesis en geles de
procesamiento de alineamientos múltiples
poliacrilamida desnaturalizantes
mediante redes neuronales.
Generalmente, las muestras proteicas se
analizaron mediante electroforesis en geles
Para la predicción de modelos de estructura
desnaturalizantes de poliacrilamida con
terciaria por homología se utilizó el servicio
dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) según
automatizado on-line SWISS-MODEL
Laemmli (1970), lo que permite separar las
(http://swissmodel.expasy.org/ ; Schwede et
proteínas en función de su peso molecular.
al., 2003)

El montaje y la electroforesis se realizaron

También se usaron las herramientas del
usando un aparato Mini-Protean-II (Bio-Rad).
ExPASy Molecular Biology Server
(http://expasy.org/ ; Gasteiger et al., 2003)
Los geles utilizados fueron geles de 2 fases, un
para la predicción de diferentes parámetros
gel de empaquetamiento al 5% de
físico-químicos de las proteínas secuenciadas.
poliacrilamida y un gel separador al 10% o al
12%, preparados de la siguiente manera:
 55

Separador Empaquetador Tampones y soluciones:

10% 12% 5% Solución de Acrilamida 30%
Solución de acrilamida: Bisacrilamida 0,8%
2 ml 2,4 ml 0,42 ml
acrilamida Tampón de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Tampón 1,56 ml 1,56 ml 0,625 ml separación: SDS 0,4%
Agua Tampón de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
2,4 ml 2 ml 1,4 ml empaquetamiento: SDS 0,4%
bidestilada
Persulfato Tampón de Tris-HCl 0,25 M pH 8,3
30 μl 30 μl 17,5 μl electroforesis Glicina 1,92 M
amónico 10%
(10X): SDS 1%
TEMED 5 μl 5 μl 5 μl
Tampón de Glicerol 10%
muestra 3X: β-mercaptoetanol 5%
Cuando se preparaban geles para la detección SDS 2,3%
Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8
de actividades mediante zimograma, se Azul de bromofenol 0,02%
sustituía parte del agua por una solución en
agua del sustrato cuya degradación se quería
estudiar, en nuestro caso xilano de madera de 8.2. Electroforesis en geles de
abedul al 0,2% final. poliacrilamida en condiciones
nativas
Las muestras, antes de ser cargadas en los
Cuando había que analizar la actividad en gel
geles, se mezclaban con tampón de muestra
de enzimas que se desnaturalizaban
3X y se trataban a 100 ºC durante 5 min para
irreversiblemente (como es el caso de XynB
desnaturalizarlas. Además de las muestras, en
de Paenibacillus barcinonensis), se recurrió a
uno de los carriles se cargaba también un
la utilización de geles de poliacrilamida
marcador comercial de pesos moleculares.
nativos (no desnaturalizantes) según Hames y
Las electroforesis se desarrollaban
Rickwood (1981).
generalmente a 75 V a través del gel de
Estos geles son similares a los de SDS-PAGE,
empaquetamiento y a 100 V a través del gel
pero los reactivos utilizados no contienen
separador.
elementos desnaturalizantes, de manera que las
proteínas migran en función de su carga
Una vez desarrollada la electroforesis, los
eléctrica y de su volumen molecular.
geles podían revelarse para la detección de
proteínas (tinción de Coomassie) o de actividad
Como en el caso del SDS-PAGE, los geles
enzimática (revelado zimográfico).
utilizados fueron geles de 2 fases, un gel de
empaquetamiento al 5% de poliacrilamida y un
gel separador generalmente al 8% o al 10%,
preparados del siguiente modo:
56

Separador Empaquetador Tampones y soluciones:

8% 10% 5% Solución de Acrilamida 30%
Solución de acrilamida: Bisacrilamida 0,8%
1,33 ml 1,66 ml 0,5 ml
acrilamida Tampón de Tris-HCl 3 M pH 8,8
Tampón 0,62 ml 0,62 ml 1 ml separación:
Agua Tampón de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
2,79 ml 2,46 ml 2 ml empaquetamiento:
bidestilada
Persulfato Tampón de Tris-HCl 0,25 M pH 8,3
250 μl 250 μl 300 μl electroforesis Glicina 1,92 M
amónico 1,5%
(10X):
TEMED 8 μl 8 μl 5 μl
Tampón de Glicerol 30%
muestra 3X: β-mercaptoetanol 5%
Para la detección de actividades mediante Tris-HCl 0,19 M pH 6,8
Azul de bromofenol 0,08%
zimograma, se sustituía parte del agua por una
solución en agua del sustrato cuya degradación
se quería estudiar, en nuestro caso xilano de 8.3. Tinción de proteínas con azul
madera de abedul al 0,2% final. de Coomassie
Una vez desarrollada una electroforesis de
Las muestras, antes de ser cargadas en los
proteínas en geles de poliacrilamida, para
geles, se mezclaban con tampón de muestra
visualizar las bandas de proteínas se teñían los
nativo 3X y no se trataban térmicamente.
geles durante 1 h con una solución de azul
Tampoco se utilizaba ningún tipo de marcador
brillante de Coomassie, y después se desteñían
de pesos moleculares, ya que las proteínas en
con ácido acético al 10% hasta observar la
estos geles no se separan en base a su peso
aparición de bandas.
molecular.

Solución para la Azul de Coomassie

Las electroforesis se desarrollaban tinción de R-250 0,05%
generalmente a 75 V a través del gel de Coomassie: Ácido acético 10%
Isopropanol 25%
empaquetamiento y a 125 V a través del gel
separador.
8.4. Revelado zimográfico
Una vez desarrollada la electroforesis, los (zimograma)
geles podían revelarse para la detección de
Se utilizaba para revelar la actividad
proteínas (tinción de Coomassie) o de actividad
enzimática de las bandas de proteínas en geles
enzimática (revelado zimográfico).
de poliacrilamida suplementados con el
sustrato de la enzima a detectar (xilano en
nuestro caso).
 57

Si los geles de poliacrilamina eran Se utilizaban geles de isoelectroenfoque

desnaturalizantes (SDS-PAGE), primero se comerciales (PhastGel® de Pharmacia) con un
lavaban con Tritón X-100 2,5% durante rango de pH de 3,0 a 9,0. Las electroforesis se
30 min, para eliminar el SDS y que las desarrollaban en un PhastSystem (Amersham
proteínas pudieran renaturalizarse. Pharmacia Biotech) según las instrucciones de
la casa comercial.
Se lavaban varias veces durante 30 min con el El marcador de pI utilizado era el Broad pI Kit
tampón adecuado para la actividad enzimática, Marker (Amersham Pharmacia Biotech), cuyo
y a continuación se incubaban los geles en el rango de pI era de 3,5 a 9,3.
mismo tampón a la temperatura adecuada
durante el tiempo necesario para que se Una vez desarrollada la electroforesis, para
pudiera dar la hidrólisis del sustrato incluido detectar la actividad xilanasa de las enzimas,
en dichos geles. los geles se lavaban con agua destilada
Los geles se teñían durante 15 min con Rojo (30 min), para después aplicarles una
Congo 0,1%, el cual se une a los sustratos sobrecapa (overlay) de agarosa 1% con xilano
polisacarídicos. A continuación, se desteñían de madera de abedul al 0,5%, e incubarlos a
con NaCl 1 M hasta que aparecían bandas de 37 ºC durante 30 - 45 min.
degradación del sustrato. Por último, se Las sobrecapas se revelaban con Rojo Congo
sumergían en ácido acético al 5% para bajar el para la detección de actividad enzimática
pH y hacer virar el rojo claro de las zonas de (zimograma). Mientras los geles de
sustrato no degradado a azul oscuro, isoelectroenfoque se revelaban para la
aumentando así el contraste con las bandas detección de proteínas (tinción de Coomassie).
claras de degradación.

8.6. Electroforesis y transferencia

8.5. Isoelectroenfoque de proteínas para su
Se utilizaba para la determinación del punto secuenciación N-terminal
isoeléctrico (pI) de las proteínas. Consiste en
El método utilizado para la secuenciación del
la aplicación de una diferencia de potencial
extremo N-terminal de proteínas por
para hacer migra las proteínas nativas a través
degradación de Edman fue el descrito por
de un gel en el que se ha formado un gradiente
Packman (1993).
de pH, de manera que estas dejaran de migrar
cuando lleguen al pH correspondiente a su pI.
Se realizaba una electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida
(SDS-PAGE), para los que la poliacrilamida
58

había sido previamente desionizada durante Tampones y soluciones:

2 h con un 5% de Analytical Grade Mixed Bed Tampón de Tris 48 mM
Resin (Bio-Rad) y después filtrada. Además, el transferencia: Glicina 39 mM
Metanol 20%
tampón de electroforesis contenía 2 mM de SDS 0,02%
ácido tioglicólico, y, antes de cargar las pH 8,3
muestras, se eliminaban los iones Solución para la Azul de Coomassie
tinción con R-250 0,01%
contaminantes que contuviera el gel aplicando Coomassie: Metanol 50%
130 V durante 20 min. Solución de Ácido acético 10%
Una vez desarrollada la electroforesis, los desteñido: Metanol 50%

geles se trataban con metanol (5 min) y se

incubaban en tampón de transferencia (5 min) 8.7. Electroforesis en geles de
antes de realizar la transferencia de las
agarosa
proteínas a una membrana de PVDF (Roche)
Las preparaciones de ADN se analizaron
utilizando un Trans-Blot Semi-Dry (Bio-Rad)
mediante electroforesis en geles de agarosa de
a 15 V durante 1 h.
baja electroendósmosis (EEO) al 0,8 - 1,3%
A continuación, las membranas se lavaban 3
(en función del tamaño de los fragmentos de
veces con agua bidestilada, se teñían las
ADN a analizar) en TBE.
proteínas transferidas con Azul de Coomassie,
El montaje y la electroforesis se realizaron en
se desteñían las membranas con una solución
cubetas horizontales Bio-Rad.
de ácido acético, y se dejaban secar.
Finalmente se recortaban las bandas de las
Las muestras se mezclaban con tampón de
proteínas de interés y se congelaba a -20 ºC.
carga 5X antes de ser cargadas en los geles.
Las electroforesis se desarrollaron
La secuenciación automática de Edman (Niall,
generalmente a 100 - 125 V.
1973) era realizada a partir de la banda
proteica por el Servei de Seqüenciació de
Una vez desarrollada la electroforesis, los
Proteïnes de l'Institut de Biologia Fonamental
geles se teñían sumergiéndolos en una solución
de la Universitat Autònoma de Barcelona
de bromuro de etidio en agua destilada
(UAB) utilizando un secuenciador Procise 492
(0,75 μg/ml) durante 15 min.
(Applied Biosystems).
 59

Tampones: 6 ºC para recuperar los sobrenadantes, libres

TBE (10X): Tris 0,9 M de ácidos nucleicos.
Ácido bórico 0,9 M
EDTA 0,02 M
pH 8,3 Para limpiar los extractos celulares
Tampón de carga Azul de bromofenol 0,25% concentrados del mayor número posible de
5X: Xilencianol 0,25% proteínas no deseadas, se procedía a una doble
Glicerol 60%
precipitación con sulfato amónico (salting
out).
9. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Primero se hacía un pequeño ensayo en que se
añadían concentraciones crecientes de sulfato
9.1. Preparación de las muestras amónico a pequeños volúmenes (0,5 ml) de

Se partía de 2 l de cultivos en fase estacionaria extractos concentrados y se ensayaba la

de la cepa que expresaba la proteína a actividad sobre pNPX de los sobrenadantes

purificar. resultantes tras centrifugar para separar las

A partir de estos cultivos se obtenían extractos proteínas precipitadas de las solubles. Este

celulares en 50 ml utilizando el método de ensayo permitía determinar la concentración

fraccionamiento por French Press descrito máxima de sulfato amónico a que la proteína

anteriormente, empleando tampón fosfato de interés se mantenía mayoritariamente

50 mM pH 7 para lavar y resuspender. soluble, y la concentración mínima a utilizar

Antes de continuar con la preparación de las para hacerla precipitar.

muestras, se comprobaba que efectivamente A continuación, a los extractos celulares

contenían la proteína de interés. En nuestro concentrados se añadía poco a poco el sulfato

caso, para comprobar la presencia de XynB o amónico necesario para llegar a la

alguna de sus variantes mutagenizadas, se concentración máxima a que la proteína de

realizaban ensayos de actividad enzimática interés se mantenía aún soluble, de manera que

sobre pNPX. tras centrifugar a 10000 r.p.m. durante 1 h a

4 ºC en una centrífuga Beckman high-speed

A continuación, se procedía a la eliminación sólo se recuperaba el sobrenadante.

de los ácidos nucleicos de las muestras. Para A este sobrenadante se le continuaba

ello, se añadía a los extractos celulares, en añadiendo poco a poco el sulfato amónico

agitación suave y poco a poco, 2,5 mg de necesario para llegar a la concentración

sulfato de estreptomicina por cada ml de mínima que hacía precipitar nuestra proteína

extracto, y se dejaba reposar a 0 ºC varias h. de interés. Así, en este segundo paso del

Después, se centrifugaba a 40000 r.p.m. en salting out, tras centrifugar a 10000 r.p.m. 1 h

una ultracentrífuga Beckman durante 50 min a

60
a 4 ºC en una centrífuga Beckman high-speed,
se recuperaba el pellet.
Por último se resuspendía este pellet en 5 ml
de tampón fosfato 50 mM pH 7 (concentración
final 400X), y se ensayaba la actividad
enzimática sobre pNPX para evaluar la
proteína a purificar.
9.2. Cromatografía en columna
Se utilizó un purificador ÄKTATM FPLCTM
(Fast Protein Liquid Chromatography) de
Amersham Biosciences para llevar a cabo las
cromatografías en columna con el fin de
purificar la proteína XynB y sus variantes
mutagenizadas.
Las columnas utilizadas, todas ellas de
Amersham Biosciences, fueron:
– Columnas de gel filtración (exclusión
molecular): permiten la separación de
proteínas en función de su tamaño. Se
utilizaron 2 columnas diferentes:
– HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 75 prep
grade: permite volúmenes de carga
relativamente elevados, manteniendo
una alta resolución. Se utilizó en el
primer paso de purificación para
eliminar la mayoría de proteínas
diferentes a la proteína de interés,
especialmente aquellas de
molecular muy elevado o muy bajo.
– Tricorn™ SuperdexTM 200 10/300 GL:
de mayor resolución que la anterior y
menor capacidad de carga.
columna se utilizó en algunas
purificaciones como un tercer paso
extra (o de polishing) después del paso
de intercambio iónico, con el fin de
eliminar totalmente algunas proteínas
de bajo peso molecular que coeluían
con XynB.
– TricornTM Mono QTM 5/50 GL: es una
columna de intercambio aniónico de alta
resolución que permite la separación de
proteínas en función de su carga eléctrica.
Esta columna se utilizó en el segundo paso
de purificación para obtener las proteínas
con un alto grado de pureza.
9.2.1. Cromatografía de gel filtración
El primer paso de purificación era pues un
paso de gel filtración, en el cual se cargaban
2 ml de los extractos concentrados con sulfato
amónico en la columna HiLoadTM 16/60
SuperdexTM 75 pg. Como eluyente se utilizaba
tampón fosfato 50 mM pH 7 con un 0,02% de
azida sódica (para evitar el crecimiento de
microorganismos), que se hacía pasar por la
columna a un flujo de 1 ml/min con una
presión máxima de 0,5 MPa.
Las fracciones se recogían de forma continua a
razón de 2 ml por fracción.
peso A continuación se seleccionaban aquellas
fracciones en que se encontraba de forma
mayoritaria la proteína a purificar. Para ello se
observaban los picos de absorbancia a 280 nm
Esta en el cromatograma resultante, y se analizaban

las fracciones que contenían dichos picos
mediante ensayos de actividad sobre pNPX y
SDS-PAGE.
Este primer paso además de permitir separar la
proteína de interés de la mayoría de proteínas
del extracto, también permitía la eliminación
del sulfato amónico (el cual eluía hacia el
final), ya que podría interferir en el siguiente
paso de purificación.
Las fracciones seleccionadas (normalmente 3
ó 4 fracciones) se mezclaban y se
concentraban en 1 ml por ultrafiltración con
unidades de filtración Centricon Ultracel
YM-10.
9.2.2. Cromatografía de intercambio
iónico
Constituía el segundo paso de purificación. En
este paso las muestras concentradas obtenidas
en el proceso anterior se cargaban en una
columna de intercambio aniónico TricornTM
Mono QTM 5/50 GL. Como eluyentes se
utilizaban dos tampones con diferente
concentración de NaCl: tampón fosfato 50 mM
pH 7, 0,02% azida sódica, sin NaCl; y tampón
fosfato 50 mM pH 7, 0,02% azida sódica, con
1 M NaCl. Estos tampones eran mezclados de
manera automática por el ÄKTATM FPLCTM
para generar un gradiente creciente de fuerza
iónica dentro de la columna a lo largo del
tiempo. La mezcla de tampones se hacía pasar
por la columna a un flujo de 2 ml/min con una
presión máxima de 4 MPa.
61
Las fracciones se recogían de forma continua a
razón de 0,5 ml por fracción, pero cuando el
FPLCTM detectaba un pico de absorbancia a
280 nm, las fracciones se reducían a 0,3 ml por
fracción, con el objetivo de obtener una mayor
resolución.
A continuación se volvían a seleccionar
aquellas fracciones en que se encontraba
solamente (o en una proporción especialmente
elevada) la proteína a purificar. Para ello se
observaban los picos de absorbancia a 280 nm
en el cromatograma resultante, y se analizaban
las fracciones que recogían dichos picos
mediante ensayos de actividad sobre pNPX y
en especial mediante SDS-PAGE.
Las fracciones seleccionadas (normalmente 3
ó 4 fracciones) se mezclaban en un sólo tubo.
9.2.3. Tercer paso opcional de
cromatografía
En algunas purificaciones, tras el paso de
intercambio iónico, aún se observaron
proteínas de bajo peso molecular que coeluían
con XynB. En estos casos, se procedió a un
tercer paso extra de purificación (polishing),
en el cual las muestras resultantes del
intercambio aniónico se cargaban en una
columna de gel filtración TricornTM
SuperdexTM 200 10/300 GL. Como eluyente se
utilizaba también tampón fosfato 50 mM pH 7
con un 0,02% de azida sódica, que se hacía
62

pasar por la columna a un flujo de 1 ml/min filtración y volviendo a centrifugar a

con una presión máxima de 1,5 MPa. 3000 r.p.m. durante 15 min, de manera que se
Las fracciones se recogían de forma continua a recogía en un tubo el volumen no filtrado
razón de 0,5 ml por fracción, pero cuando el concentrado.
FPLCTM detectaba un pico de absorbancia a
280 nm, las fracciones pasaban a ser de 0,3 ml
por fracción, para obtener una mayor
resolución.

Por último se seleccionaban de nuevo aquellas

fracciones en las que se encontraba solamente
la proteína a purificar mediante ensayos de
actividad enzimática sobre pNPX y mediante
SDS-PAGE.

Las fracciones seleccionadas se mezclaban en

un solo tubo.

9.3. Concentración de proteínas

por ultrafiltración
Se utilizaban unidades de filtración Centricon
de Millipore, que contenían filtros de celulosa
regenerada de baja adherencia y con exclusión
de pesos moleculares de 10 ó 30 kDa (modelos
Ultracel YM-10 y YM-30, respectivamente).

Se centrifugaba a 3000 r.p.m. en una

centrifuga Beckman high-speed hasta que
pasaba por el filtro la mayor parte del volumen
de la muestra a concentrar y sólo quedaba sin
filtrar el volumen deseado.

Por último se recuperaban las proteínas

concentradas invirtiendo la unidad de
CAPÍTULO I.
LA XILANASA XYNA DE BACILLUS SP. BP-7

1. - INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La biodegradación del xilano es un proceso
complejo que requiere la acción coordinada de
diferentes enzimas, entre las cuales las
xilanasas juegan un papel fundamental al
degradar los enlaces β(1→4) del esqueleto de
xilosas del xilano.
La cepa Bacillus sp. BP-7 (López et al. 1998)
había sido previamente aislada por el grupo de
investigación a partir de suelo de arrozal del
Delta de L'Ebre (lugar rico en materia vegetal
en descomposición y por tanto adecuado para
aislar degradadores de celulosa y xilano),
mediante cultivos de enriquecimiento en paja
de arroz. Esta cepa fue seleccionada por su
elevada actividad degradadora de xilano,
además de presentar actividad hidrolítica sobre
celulosa, pectina y lípidos.
Con el fin de encontrar y caracterizar nuevas
xilanasas para su análisis, tanto molecular
como de aplicación industrial, los objetivos de
este capítulo fueron:
- Construcción de una genoteca en
Escherichia coli de la cepa Bacillus sp.
BP-7, selección de los clones
recombinantes portadores de genes de
xilanasas, e identificación y caracterización
genética de los mismos.
- Caracterización bioquímica de la xilanasa
mayoritaria de la cepa Bacillus sp. BP-7.
65
- Expresión de las enzimas caracterizadas en
forma de proteínas de fusión en estudios de
secreción fúngica.
2. - RESULTADOS
2.1. Clonación e identificación de
xilanasas de Bacillus sp. BP-7
2.1.1. Construcción y escrutinio de la
genoteca de Bacillus sp. BP-7
Con el objetivo de clonar e identificar los
genes codificantes de enzimas degradadores de
polisacáridos y lípidos (xilanasas, celulasas,
lipasas, esterasas y pectinasas) de la cepa
Bacillus sp. BP-7, se construyó una genoteca
de la misma en colaboración con el resto de
miembros del grupo de investigación.
Para la construcción de la genoteca, el ADN
total de Bacillus sp. BP-7 fue digerido a
tiempo parcial con el enzima de restricción
Sau3A. El ADN resultante fue sometido a
electroforesis en geles preparativos, a partir de
los cuales se aislaron fragmentos de tamaño
medio aproximado entre 6 y 8 kb. Estos
fragmentos fueron ligados al plásmido pUC19
linearizado con BamHI, y el resultado de la
ligación fue introducido por transformación en
E. coli XL1-Blue. Se sembró a continuación
en placas de agar LB suplementado con
tetraciclina, ampicilina, IPTG y X-gal, que se
incubaron 24 h a 37 ºC. A partir de las
colonias que crecieron en estas placas se
66

seleccionaron alrededor de 4500 clones colonias con actividad xilanasa presentaban a

recombinantes (colonias blancas y AmpR) para
su posterior análisis.
Para el escrutinio de la genoteca, los clones
recombinantes seleccionados se sembraron en
placas de agar LB suplementado con distintos
sustratos para revelar la producción de las
enzimas de interés. Estos sustratos fueron:
CMC para identificar clones productores de
celulasas, ácido poligalacturónico para
detectar clones con actividad pectinasa,
tributirina para detectar clones positivos para
esterasas, y aceite de oliva para detectar clones
con actividad lipasa. Para identificar clones
positivos para actividad xilanasa, se usaron
placas de agar LB suplementadas con xilano
de espelta de avena (0,4%). Estas placas eran
turbias debido al xilano, de manera que las
su alrededor un halo claro resultante de la
degradación del xilano. Sin embargo, la
sensibilidad de estas placas para identificar
clones con actividad xilanasa es relativamente
baja. Por ello en ocasiones se usaron también
placas de agar LB suplementadas con
xilano-RBB (0,1%), con mayor sensibilidad, y
que por tanto permiten detectar clones con
niveles bajos de actividad xilanasa. En las
placas de agar LB xilano-RBB las colonias
productoras de xilanasas se detectan por la
formación de halos claros que destacan sobre
el fondo azul oscuro del medio (Figura I.2.1).
Tras el escrutinio de más de 4500 clones
recombinantes se identificaron 3 clones
productores de lipasa, 1 clon productor de
pectinasa y 6 clones productores de xilanasa.

Bacillus sp.  pXA1   pXA2  pXA5

BP­7 pXA3   pXA7  pXA6 Selección de 
Extracción  clones con 
de DNA
actividad 
xilanasa
DNA 
(con halo de 
Cromosómico Vector degradación del 
Digestión (pUC19) xilano del medio)
parcial con 
Sau3A Selección de 
DNA 
Digestión  clones 
digerido
con BamH1 recombinantes
Vector  (colonias  blancas 
DNA 
digerido AmpR)
(tamaños deseados)
Ligación

Transformación 
en E. coli XL1­Blue

Figura I.2.1: Construcción y escrutinio de la genoteca de Bacillus sp. BP-7.

 67

Los 6 clones recombinantes con actividad Se observó que los plásmidos recombinantes
xilanasa se clasificaron en 2 grupos: pXA1, pXA2, pXA3 y pXA7 presentaban
- Clones XA1, XA2, XA3, y XA7. muchas bandas de restricción comunes, lo cual
Presentaban actividad en placas de agar LB indicaba que una gran parte del inserto que
suplementadas con xilano de espelta de contenían era común a todos ellos.
avena o con xilano-RBB. Por otra parte, se constató que los plásmidos

- Clones XA5 y XA6. Mostraban actividad pXA5 y pXA6 presentaban un patrón de

detectable únicamente en placas de agar restricción idéntico, hecho que indicaba que

LB con xilano-RBB. los clones XA5 y XA6 contenían el mismo

Los clones fueron congelados en glicerol a plásmido. Dicho patrón de restricción era

-80 ºC para su conservación. además totalmente distinto al de los otros

plásmidos recombinantes.
Así pues, los 6 clones productores de xilanasa
2.1.2. Análisis de los clones con
correspondían únicamente a 2 fragmentos
actividad xilanasa
distintos del ADN de Bacillus sp. BP-7.

2.1.2.1. - Análisis de los plásmidos Sobre la base de estos resultados, para

recombinantes posteriores estudios se seleccionaron 2 clones.

Del grupo de clones XA1, XA2, XA3 y XA7
El ADN plasmídico (obtenido por
se escogió al XA3 por ser el que presentaba un
minipreparación) de los clones productores de
inserto de menor tamaño; y del grupo de
xilanasa fue analizado mediante digestiones
clones XA5 y XA6 (ambos idénticos) se
simples y dobles con enzimas de restricción.
escogió XA5.
A partir de estos análisis de restricción se
obtuvo el tamaño de los insertos de los
diferentes clones, tal como aparece en la Tabla 2.1.2.2. - Subclonaje del inserto de pXA3
I.2.1.
Para delimitar el gen de xilanasa y eliminar el
ADN no necesario para la expresión del
Tabla I.2.1: Tamaño del inserto de los plásmidos enzima, se procedió a subclonar el inserto de
recombinantes.
pXA3, contenido en el clon recombinante
Plásmido Tamaño XA3.
Clon Recombinante del inserto (kb)
Para ello se digirió el inserto del plásmido
XA1 pXA1 7,2
XA2 pXA2 8,9 pXA3 con diferentes enzimas de restricción, se
XA3 pXA3 6,0 clonaron los fragmentos digeridos en pUC19 y
XA5 pXA5 8,7
se transformó en células competentes de
XA6 pXA6 8,7
XA7 pXA7 6,8 E. coli XL1 Blue.
68

A partir del clon XA3 se obtuvo el subclón 2.1.3. Secuenciación e identificación

XA30, que presentaba actividad xilanasa y del gen xynA
contenía el plásmido pXA30, el cual consistía Se secuenció el inserto de pXA30, usando para
en el fragmento HindIII de 1,4 kb del inserto ello cebadores que flanqueaban el sitio de
de pXA3 clonado en pUC19 (Figura I.2.2). clonación múltiple de pUC19. La secuencia
obtenida (Figura I.2.3) mostró una pauta
HindIII
LacZ abierta de lectura de 639 bp, que codificaba
una proteína de 213 aminoácidos, con un peso
xynA molecular teórico de 23474,7 Da y un pI
Amp R
teórico de 9,28, a la que se denominó XynA
pXA30 (xilanasa A de Bacillus sp. BP-7).
4,09 kb
Inserto
(1,4 kb) La secuencia deducida de aminoácidos se
HindIII comparó con secuencias de glicosil hidrolasas
ORI LacI conocidas contenidas en las bases de datos
(Swissprot, NCBI, EMBL y SubtiList). Se
Figura I.2.2: Plásmido pXA30. encontró una elevada homología (92% de
identidad) con la xilanasa A de Bacillus
La cuantificación de actividad xilanasa en subtilis (Paice et al., 1986), la xilanasa A de
extractos celulares del subclón obtenido, en Bacillus circulans (Yang et al., 1988) y la
comparación con la del clon original y del xilanasa S de Bacillus sp. YA-14 (Yu et al.,
control negativo, se muestra en la Tabla I.2.2. 1993); y una menor homología con XynA de
B. stearothermophilus (78% de identidad)
(Cho y Choi, 1995), XynN de B. halodurans
Tabla I.2.2: Actividad xilanasa en placa y en
ensayos de actividad de los clones y subclones (75% de identidad) (EMBL accession number
obtenidos. AY170624), XynA de B. pumilus (46% de
identidad) (Fukusaki et al., 1984) y con XynA
Clones Actividad U/ml
recombinantes en placa de cultivo de B. agaradhaerens (45% de identidad)
E. coli/pXA3 (EMBL accession number A68006), todas
+ 0,03
(XA3)
E. coli/pXA30 ellas xilanasas de la familia 11 (G) de glicosil
+ 0,03
(XA30) hidrolasas (Gilkes et al., 1991; Henrissat y
E. coli/pXA5
+ 0,01 Bairoch, 1996).
(XA5)
E. coli/pUC19
- 0,00
(C –)
 69

47   GCT ACC TCA TGT CAA AGT CAG AAA AAA TAT TAT AGG AGG TAA CAT  91

92   ATG TTT AAG TTT ACA AAG AAA TTC TTA GTT GGG TTA ACG GCA GCT  136
1    Met Phe Lys Phe Thr Lys Lys Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala  15

137  TTG ATG AGT ATT AGC TTG TTT TCG GCA AAC GCC TCT GCA GCT AAC  181
16   Leu Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Asn Ala Ser Ala Ala Asn  30

182  ACA GAC TAC TGG CAA AAT TGG ACT GAT GGG GGC GGA ACA GTA AAC  226
31   Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn  45

227  GCT GTC AAT GGG TCT GGC GGG AAT TAC AGT GTG AAT TGG TCT AAT  271
46   Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn  60

272  ACC GGG AAT TTC GTT GTT GGT AAA GGT TGG ACT ACA GGT TCG CCA  316
61   Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro  75

317  TTT AGG ACG ATA AAC TAT AAT GCC GGA GTT TGG GCG CCG AAT GGC  361
76   Phe Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly  90

362  AAT GCA TAT TTG ACT TTA TAT GGT TGG ACG CGA TCA CCT CTC ATA  406
91   Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile  105

407  GAA TAT TAT GTA GTG GAT TCA TGG GGT ACT TAT AGA CCT ACT GGA  451
106  Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly  120

452  ACG TAT AAA GGT ACG GTT TAC AGT GAT GGG GGT ACA TAT GAC GTG  496
121  Thr Tyr Lys Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Val  135

497  TAC ACA ACT ACA CGT TAT GAT GCA CCT TCC ATT GAT GGC GAT AAA  541
136  Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asp Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Lys  150

542  ACT ACT TTT ACG CAG TAC TGG AGT GTT CGC CAG TCG AAG AGA CCA  586
151  Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro  165

587  ACT GGA AGC AAC GCT ACA ATC ACT TTC AGC AAT CAC GTT AAC GCA  631
166  Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala  180

632  TGG AAG AGA TAT GGG ATG AAT CTG GGT AGT AAT TGG TCT TAC CAA  676
181  Trp Lys Arg Tyr Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp Ser Tyr Gln  195

677  GTC TTA GCG ACA GAG GGA TAT CAA AGT AGT GGA AGT TCT AAC GTC  721
196  Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val  210

722  ACA GTG TGG TAA CAG ATT ATC TTT AAT CAG GGG TAG CTA ACG GGC  766
211  Thr Val Trp Stop                       

767  TGC TGA TCG TTC CTT GAG AAA TTT TAT AAT CGT TGT TAT TGT GAG  811

Figura I.2.3: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen xynA
de Bacillus sp. BP-7.

Tal como se observa en el alineamiento glutámicos en posiciones 106 y 200.

múltiple (Figura I.2.4), la homología con las
Según se observó en estos análisis de
xilanasas mencionadas en primer lugar es muy
secuencia, la xilanasa XynA de Bacillus sp.
elevada, conservándose en todas ellas los dos
BP-7 es una enzima de dominio único, de la
residuos catalíticos del centro activo del
familia 11 (G) de glicosil hidrolasas, y dentro
enzima, correspondientes a los ácidos
70

Figura I.2.4: Alineamiento múltiple de XynA de Bacillus sp. BP-7 (XynA_BP-7), XynA de Bacillus
subtilis (XynA_B.sub), XynA de Bacillus circulans (XynA_B.cir) y XynS de Bacillus sp. YA-14
(XynS_B.sp.) (Yu et al., 1993).

de ella pertenece al subgrupo de xilanasas (E. coli/pUC19). Los geles de electroforesis

alcalinas de bajo peso molecular, el cual resultantes fueron revelados para proteínas por
parece ser ubicuo entre las especies del género tinción con azul de Coomassie y para actividad
Bacillus y ha sido propuesto como el principal xilanasa mediante técnicas zimográficas
subgrupo de la familia 11 de glicosil (Figura I.2.5).
hidrolasas.
En los geles teñidos con azul de Coomassie no
se observaron diferencias significativas en el
2.2. Caracterización bioquímica patrón de bandas proteicas del extracto celular
de la xilanasa XynA de de E. coli/pXA30 respecto al del control
Bacillus sp. BP-7 negativo. Sin embargo, en los geles
desarrollados zimográficamente se observó
2.2.1. Determinación del peso una banda intensa de actividad xilanasa en el
molecular y del punto isoeléctrico extracto celular de E. coli/pXA30, que no se
Para analizar el producto génico de xynA observó en el control negativo. Esta banda de
expresado en la cepa recombinante actividad xilanasa presentaba un peso
E. coli/pXA30 se obtuvieron extractos molecular aparente de unos 23 - 24 kDa, que
celulares concentrados de dicha cepa concuerda con el peso molecular teórico
recombinante y se analizaron mediante deducido a partir de su secuencia aminoacídica
electroforesis en geles de poliacrilamida con (23474,7 Da).
SDS (SDS-PAGE), junto a los extractos
celulares concentrados de un control negativo
 71

Figura I.2.6: Análisis

zimográfico a partir de
geles de
isoelectroenfoque de la
xilanasa A (extractos de
E. coli/pXA30).

Figura I.2.5: Análisis electroforético mediante crudos del subclón E. coli/pXA30 sobre
SDS-PAGE de la xilanasa A. diferentes xilanos (xilanos de maderas duras y
(A) Tinción con azul de Coomassie.
(B) Zimograma para actividad xilanasa. xilanos de cereales), celulosas (Avicel y
(1) Extractos de E. coli/pUC19 (C−).
carboximetil celulosa), otros polisacáridos
(2) Extractos de E. coli/pXA30.
(laminarina, liquenano, poligalacturonato,
Los extractos celulares de E. coli/pXA30, pectina y almidón), además de sobre
fueron también analizados en geles de aril-xilósidos (pNPX y oNPX) y otros
isoelectroenfoque que se revelaron aril-glicósidos (pNAp, pNAf y pNPG)
zimográficamente para actividad xilanasa. (Tabla I.2.3).
Se observó una única banda de actividad en el
límite de pH superior de los geles, lo que La xilanasa A presentó elevada actividad sobre
indica que XynA posee un pI de 9 o superior los distintos xilanos de maderas duras y
(Figura I.2.6), tal como era de esperar en cereales ensayados, obteniéndose los valores
función de su pI teórico (9,28). más altos sobre xilano de madera de haya
(0,207 U/mg de proteína). Por el contrario, la
actividad sobre celulosas, otros polisacáridos,
2.2.2. Propiedades enzimáticas
aril-xilósidos y aril-glicósidos evaluados, fue
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato muy baja o indetectable.

Se hicieron estudios de especificidad de

sustrato ensayando la actividad de extractos
72

Tabla I.2.3: Especificidad de sustrato de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7.

Actividad
específica % respecto a la
Sustrato (U/mg) a actividad máxima
Xilano de madera de abedul 0,182 87,92
Xilano de madera de haya 0,207 100,00
Metil glucuronoxilano 0,139 67,15
Xilano de espelta de avena 0,145 70,05
Arabinoxilano de trigo 0,164 79,23
Arabinoxilano de centeno 0,054 26,09
Carboximetil celulosa ND 0
Avicel ND 0
Laminarina ND 0
Liquenano 0,003 1,45
Poligalacturonato ND 0
Pectina 0,003 1,45
Almidón 0,003 1,45
pNPX 0,001 0,48
oNPX 0,001 0,48
pNPG 0,001 0,48
pNPAp 0,001 0,48
pNPAf 0,002 0,97

a
ND: No Detectable

La especificidad de sustrato mostrada por Se ensayó la actividad de extractos crudos de

XynA indica que se trata de una endoxilanasa
(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8).
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima
A continuación se determinaron el pH óptimo
(pH al que el enzima tiene máxima actividad)
y la temperatura óptima (temperatura a la que
el enzima presenta máxima actividad) de la
enzima, con el fin de determinar
condiciones de aplicación de la misma en
posibles usos industriales.
E. coli/pXA30 sobre xilano de madera de
abedul en el rango de pH de 3 a 12 en
intervalos de 0,5 unidades de pH, a una
temperatura de 60 ºC (Figura I.2.7).
A partir de estos ensayos se observó que el pH
óptimo de XynA en extractos crudos es de 6,0,
manteniendo más de un 50% de actividad en el
rango de pH entre 4,5 y 8,5.
las Para determinar la temperatura óptima, se
analizó la actividad de los extractos crudos de
E. coli/pXA30 sobre xilano de madera de
 73

100
100
Actividad relativa (%)

90
80

Actividad Relativa (%)

80
60

70
40

20 60

0 50
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 55 60 65 70
pH Temperatura (ºC)

Figura I.2.7: Efecto del pH sobre la actividad de Figura I.2.8: Efecto de la temperatura sobre la
XynA. actividad de XynA.

abedul, a pH 6, en el rango de temperaturas de que a 60 ºC la enzima se inactivó rápidamente,

50 a 70 ºC, en intervalos de 5 ºC (Figura I.2.8). no mostrando actividad significativa tras 1 h
Los resultados mostraron que la temperatura de incubación en estas condiciones.
óptima de XynA en extractos crudos es de
60 ºC, presentando más de un 50% de 100 50 ºC
actividad a temperaturas entre 50 y 70 ºC.
Actividad relativa (%)

80
55 ºC
60

2.2.2.3. - Termorresistencia 40

Para analizar la termorresistencia (o 20 60 ºC

termoestabilidad) de la enzima, muestras de
0
extractos crudos de E. coli/pXA30 se 30 60 90 120 150 180
Tiempo de preincubación (min.)
incubaron a 50, 55 ó 60 ºC durante diferentes
intervalos de tiempo (hasta un máximo de 3 h) Figura I.2.9: Termorresistencia de XynA a pH 7.
a pH 7, y posteriormente se ensayó la
actividad xilanasa residual sobre xilano de
madera de abedul (Figura I.2.9). 2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre
la actividad
La xilanasa cruda se mostró altamente estable
Por último, se comprobó la influencia de
a 50 ºC, manteniendo el 100% de su actividad
diferentes cationes metálicos sobre la actividad
tras las 3 h de incubación ensayadas.
de la xilanasa A cruda.
Por el contrario, tras 3 h de incubación a 55 ºC
Para ello, se realizó el ensayo de actividad
la actividad disminuyó hasta el 50%; mientras
xilanasa en presencia de diferentes cationes
74

1 mM 10 mM
120
110
100
Actividad Relativa (%)

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

EDTA
Mg2+
NH4+
Mn2+

C+
Cu2+

Pb2+

Ag2+

Hg2+
Co2+
Ni2+

Zn2+
Ca2+
Fe3+

Ba2+

Figura I.2.10: Influencia de diferentes iones y EDTA a 1 y 10 mM sobre la actividad de XynA.

metálicos a una concentración final de 1 mM o a 10 mM, aumentando la actividad hasta un

10 mM. Con el fin de observar el efecto de la
falta de iones sobre la actividad, también se
realizaron ensayos añadiendo EDTA (1 o
10 mM).
Tal como se observa en la Figura I.2.10, la
xilanasa A fue inhibida en mayor o menor
grado por casi todos los cationes ensayados a
concentraciones de 10 mM.
Es de destacar el efecto inhibidor de los iones
2+ 3+ 2+
Mn , Fe , Pb y Hg , que a concentraciones
de 10 mM redujeron la actividad por debajo
del 25 % respecto al control + (sin iones). De
estos 4 iones, sólo el Hg no mostraba efecto
inhibidor a concentraciones de 1 mM. Por el
2+
contrario, el Ba presentaba un ligero efecto
activador sobre la xilanasa tanto a 1 mM como
112% y un 110% de la actividad del control +.
2.3. Expresión de la xilanasa
XynA en levadura
2.3.1. Antecedentes
El bajo peso molecular (24 kDa), la alta
actividad sobre arabinoxilanos de trigo (79%
de la actividad máxima), el amplio rango de
2+
pH (4,5 - 8,5) y la termoestabilidad (3 h a
50 ºC) son características bioquímicas de la
xilanasa A de Bacillus sp. BP-7 que la
2+
convierten en una buena candidata para su uso
en la industria panadera, con el fin de mejorar
las propiedades reológicas del pan. Es por ello
que se decidió ensayar su expresión en
Saccharomyces cerevisiae.
 75

Como estrategia para conseguir la secreción de secretada parcialmente al medio de cultivo;

la xilanasa A en esta levadura se decidió su Moukadiri et al., 1999), tal como se describe
fusión génica a proteínas de pared celular, que en la Figura I.2.11.
trasportaran la xilanasa al exterior de la
Las 5 construcciones realizadas (C1 - C5),
superficie celular de la levadura.
basadas en el plásmido de expresión en
levaduras YEplac112, fueron transformadas en
En colaboración con el grupo del Dr. Jesús
las cepas de S. cerevisiae BY4741 (cepa
Zueco de la Universitat de València, se
salvaje) y S. cerevisiae mnn9 (cepa deficiente
construyeron 5 proteínas de fusión diferentes.
en glicosilación; Hernández et al., 1989).
En ellas, la pauta abierta de lectura de XynA,
sin la región que codifica el péptido señal, se
fusionó en distintos puntos con el gen
codificante de la proteína Pir4 (proteína de
pared de S. cerevisiae, que además es

NcoI BglII SalI

Pir4 XynA
PS SI MP S II PS Xilanasa

Amplificación de la región codificante, sin

Digestión con enzimas de restricción incluir el PS, usando cebadores que
incorporan dianas de restricción

NcoI NcoI
C1

BglII BglII
C2

SalI SalI

C3

NcoI BglII SalI

C4
NcoI SalI
C5

Figura I.2.11: Construcciones XynA-Pir4. PS: región codificante para el péptido señal; S I: región
codificante para la subunidad I de Pir4 (pro-péptido procesado en el aparato de Golgi); MP: región
codificante para el motivo Pir (repeticiones internas); S II: región codificante para la subunidad II de Pir4
(la región C-terminal de esta subunidad posiblemente permite el anclaje a la pared).
76

2.3.2. Análisis de actividad de los S. cerevisiae BY4741, siendo especialmente

clones recombinantes
Para proceder al estudio de la actividad
xilanasa de los 10 clones obtenidos (5 en
S. cerevisiae BY4741 y 5 en S. cerevisiae
mnn9), éstos fueron sembrados en placas de
Agar SD (his, leu, met) suplementado con
Xilano-RBB al 0,1%. También se sembró la
cepa E. coli/pXA30 como control +, y las
cepas parentales S. cerevisiae BY4741 y
S. cerevisiae mnn9 como controles –.
Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48 h,
al cabo de las cuales se analizó la aparición de
halos de degradación del xilano alrededor de
las estrías de crecimiento microbiano.
Tal como se observa en la Figura I.2.12, los
clones con las construcciones C2, C3 y C4
presentaron halos de degradación del xilano
alrededor de las estrías de crecimiento, tanto
los derivados de la cepa S. cerevisiae mnn9
como los derivados de la cepa salvaje
notables los halos de los clones que contenían
la construcción C4, cuyos halos resultaron más
intensos que los del control +. En el caso de la
construcción C1 también se observaron halos
de degradación del xilano en ambas cepas
huéspedes, sin embargo estos eran muy tenues
en comparación con los de las otras
construcciones.
Por el contrario, la construcción C5 no mostró
halos de degradación en ninguna de las 2 cepas
huéspedes.
Con este ensayo en placa comprobamos que
las proteínas de fusión expresadas por algunos
de los clones recombinantes eran funcionales,
quedando pues por determinar la localización
celular de estas proteínas de fusión en los
diferentes clones.

A B
C2 C1 C2 C1

C5 C4 C3 C5 C4 C3

C+ C- C+ C-

Figura I.2.12: Ensayo de actividad en placa de las 5 construcciones obtenidas (clones del 1 al 5) en
S. cerevisiae mnn9 (placa A) y S. cerevisiae BY4741 (placa B).
 77

2.3.3. - Localización celular sobrenadantes fueron concentrados 40 veces

Aquellos clones positivos para actividad
xilanasa que resultaban más activos
(construcciones C2, C3 y C4), fueron
cultivados en medio líquido SD (his, leu, met)
para poder obtener sobrenadantes de cultivo y
fracciones de pared celular sobre los que
realizar análisis cuantitativos de actividad
xilanasa. Las cepas huéspedes también fueron
cultivadas en medio YPD para utilizarlas como
controles −.
Los sobrenadantes de cultivo fueron dializados
y concentrados antes de realizar los ensayos de
actividad. La diálisis se realizó frente a tampón
Tris-HCl 200 mM pH 7, para eliminar los
azúcares presentes en los medios de cultivo
utilizados (ya que ambos contenían, entre
otros, un 2% de glucosa) y evitar así la
interferencia de estos azúcares reductores con
el método de detección de actividad xilanasa
(Nelson-Somogyi). Una vez dializados, los
(40X) mediante varios pasos de ultrafiltración.
A continuación se ensayó la actividad xilanasa
de los sobrenadantes concentrados en las
condiciones óptimas de pH y temperatura
previamente establecidas.
Las paredes celulares fueron procesadas y
analizadas paralelamente por Isabel Andrés,
del grupo del Dr. Jesús Zueco.
Tal como se observa en la Tabla I.2.4, todos
los clones analizados presentaron actividad
xilanasa significativa asociada a pared celular,
aunque en el caso de la construcción C4, ésta
fue muy inferior a la mostrada por las
construcciones C2 y C3 en las mismas cepas.
En cuanto a la actividad liberada a los
sobrenadantes de cultivo, en el caso de los
clones en la cepa S. cerevisiae BY4741 sólo la
construcción C4 presentaó valores
significativos de actividad xilanasa; mientras
que en los clones derivados de la cepa
S. cerevisiae mnn9 todos los sobrenadantes de

Tabla I.2.4: Actividad xilanasa asociada a pared y en sobrenadantes de cultivo de las construcciones C2, C3
y C4 en las cepas S. cerevisiae BY4741 y S. cerevisiae mnn9.
Actividad asociada a pared celular Actividad en sobrenadantes de cultivo
Cepa U/g pared U/l cultivo % U/l cultivo %
BY4741 0,00 0,00 0 0,00 0
C2-BY4741 1,80 5,76 100 0,00 0
C3-BY4741 1,50 4,80 96 0,19 4
C4-BY4741 0,45 1,10 11 8,43 89
mnn9 0,00 0,00 0 0,00 0
C2-mnn9 0,93 5,95 76 1,83 24
C3-mnn9 1,17 7,50 43 9,85 57
C4-mnn9 0,35 2,20 13 14,33 87
78

los clones recombinantes analizados, aunque

especialmente los del que contenía la
construcción C4, presentaron actividad
xilanasa significativa.
Así pues, destacaba especialmente la elevada
actividad xilanasa presente en los
sobrenadantes de los dos clones que contenían
la construcción C4, en los que el 87 - 89% de
la actividad xilanasa total fue secretada al
medio de cultivo.
CAPÍTULO II.
LAS XILANASAS YNFF Y XYND DE
BACILLUS SP. BP-7
 81

1. - INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 2. - RESULTADOS

Tal como se ha descrito en el capítulo anterior,
el escrutinio de la genoteca de la cepa 2.1. Aislamiento de las xilanasas
Bacillus sp. BP-7 en Escherichia coli dio lugar del clon Escherichia coli/pXA5
al aislamiento de 2 tipos de clones productores Tras analizar el ADN plasmídico de los clones
de xilanasa: los clones del primer tipo (XA1, XA5 y XA6, se observó que los plásmidos
XA2, XA3, y XA7) contenían todos ellos el pXA5 y pXA6 presentaban el mismo tamaño
gen xynA, caracterizado en el capítulo anterior, (8,7 kb) y un patrón de restricción idéntico, y a
mientras que el segundo tipo de clones, su vez distinto al de los plásmidos
formado por XA5 y XA6, sólo mostraba recombinantes que codificaban para la
actividad detectable en placas de agar LB con xilanasa A, descrita en el capítulo anterior.
xilano-RBB, lo que indicaba la presencia de,
como mínimo, una xilanasa con características Sobre la base de estos resultados, se seleccionó
diferentes a XynA. el clon XA5 (E. coli/pXA5) para continuar con
su estudio.
El objetivo del presente capítulo fue la
caracterización genética y bioquímica de las
2.1.1. Subclonaje del inserto del
xilanasas de la cepa Bacillus sp. BP-7 clonadas
plásmido pXA5
en XA5 y XA6.
Con el objetivo de delimitar los posibles genes
de xilanasa y eliminar el ADN no necesario
para la expresión de las mismas, se procedió a
subclonar el inserto de pXA5. Para ello se
digirió el inserto del plásmido pXA5 con
diferentes enzimas de restricción, se clonaron
los fragmentos digeridos en pUC19 y se
transformó en células competentes de E. coli
XL1-Blue.
La poca cantidad de dianas de restricción
útiles en el inserto dificultó la subclonación.
Finalmente, tras varios intentos, se obtuvieron
2 subclones, conteniendo los plásmidos
pXA50 y pXA51, consistentes
respectivamente en los fragmentos EcoRI de
82

1,9 kb y 2,2 kb del inserto de pXA5 clonados los subclones), usando para ello cebadores que
en pUC19. Pero ninguno de estos 2 subclones flanqueaban el sitio de clonación múltiple de
presentó actividad xilanasa (Tabla II.2.1). pUC19. La secuenciación reveló que el inserto
de pXA5 era homólogo a la región del genoma
Tabla II.2.1: Actividad xilanasa de los clones y de Bacillus subtilis entre 1940 kb y 1949 kb
subclones obtenidos.
(Kunst et al., 1997). Esta región de Bacillus
Clones Actividad U/ml subtilis (Figura II.2.1) contenía, entre otros, los
recombinantes en placa de cultivo
genes bglC (anotado como endoglucanasa),
E. coli/pXA5 (XA5) + 0,01
E. coli/pXA50 (XA50) - 0,00 ynfF (gen de función desconocida homólogo a
E. coli/pXA51 (XA51) - 0,00
genes de xilanasas) y xynD (anotado como
E. coli/pUC19 (C -) - 0,00
xilanasa).

2.1.2. Secuenciación e identificación de

La nueva información permitió diseñar
los genes de pXA5
cebadores para avanzar en la secuenciación de
Puesto que no se obtuvieron subclones activos,
zonas concretas del inserto de pXA5,
se secuenciaron los extremos de los insertos de
comprobándose que el plásmido contenía 2
pXA5 y de pXA50 y pXA51 (contenidos en

pXA5

Subclonación

pXA50 pXA51

Secuenciación y
Búsquedas de homología

ynfF xynD

Figura II.2.1: Región del genoma de Bacillus subtilis con homología al inserto de pXA5,
conteniendo los genes bglC, ynfF y xynD.
 83

pautas abiertas de lectura homólogas a los algunas de las proteínas homólogas a la

genes ynfF y xynD de Bacillus subtilis. nuestra (entre ellas XynD de Paenibacillus
polymyxa) han sido caracterizadas
bioquímicamente presentando actividad
2.1.2.1.- Secuencia y homología de xynD de
arabinofuranosidasa, además de actividad
Bacillus sp. BP-7
xilanasa.
La pauta abierta de lectura contenida en pXA5
que presentaba muy alta homología con el gen
xynD de Bacillus subtilis, pasó a denominarse 2.1.2.1.- Secuencia y homología de ynfF de
xynD de Bacillus sp. BP-7 (Figura II.2.2). Bacillus sp. BP-7
La proteína deducida de esta pauta abierta de Por otro lado, la pauta abierta de lectura del
lectura, XynD de BP-7, contiene 512 inserto de pXA5 que presentaba homología
aminoácidos, y muestra un peso molecular con el gen ynfF de Bacillus subtilis, pasó a
teórico de 54243,9 Da y un pI teórico de 8,17. denominarse ynfF de Bacillus sp. BP-7
(Figura II.2.3).
Las búsquedas de homología en bases de datos Esta pauta abierta de lectura codifica una
(NCBI y SubtiList) mostraron que la proteína proteína de 423 aminoácidos, con un peso
XynD de Bacillus sp. BP-7 presentaba alta molecular teórico de 47608,6 Da y un pI
homología con XynD de Bacillus subtilis 168 teórico de 8,80, a la que se denominó YnfF.
(84% de identidad) (Kunst et al., 1997), tal
como se esperaba, con XynD de Paenibacillus Los estudios de homología de secuencia que se
polymyxa (64% de identidad) (Gosalbes et al., realizaron (NCBI y SubtiList) mostraron alta
1991), XynA de Caldicellulosiruptor sp. homología entre YnfF de Bacillus sp. BP-7 e
Tok7B.1 (49% de identidad) (Gibbs et al., YnfF de Bacillus subtilis 168 (92% de
2000), una xilanasa de Caldicellulosiruptor sp. identidad) (Kunst et al., 1997). Asimismo, se
Rt69B.1 (48% de identidad) (NCBI halló alta homología con una endoxilanasa de
AAB95326) y XynF de Caldicellulosiruptor Aeromonas punctata W-61 (79% de identidad)
saccharolyticus (48% de identidad) (Luthi et (NCBI BAA13641), la xilanasa D de
al., 1990). Aeromonas caviae ME-1 (77% de identidad)
Muchas de estas enzimas pertenecen a la (Suzuki et al., 1997) y la xilanasa A de
familia 43 de glicosil hidrolasas en lugar de a Pectobacterium chrysanthemi D1 (39% de
las familias 10 y 11, típicas de xilanasas. identidad) (Keen et al., 1996).
Resulta de interés señalar en este punto que la Todas estas enzimas presentan homología a
familia 43 contiene mayoritariamente enzimas glicosil hidrolasas de la familia 5, en lugar de a
con actividad arabinofuranosidasa, y que xilanasas de las familias 10 u 11.
84
496   CCC CAT TTT TAG AAA AAA GGA GGA TGT TAA GTC ATG AGT AAA AAG   540
                                                  Met Ser Lys Lys   4

541   TGT AGC GTA TGT TTA TGG GTT CTT GCT TTA TTA TTG AGT TGC TTA   585
5     Cys Ser Val Cys Leu Trp Val Leu Ala Leu Leu Leu Ser Cys Leu   19

586   TTT GGG GAG TCT GCG TAT GCA GCC AGT ACT ACA ATT GCA AAA CAT   630
20    Phe Gly Glu Ser Ala Tyr Ala Ala Ser Thr Thr Ile Ala Lys His   34

631   GCA GGG AAT TCA AAC CCC CTT ATA GAC CAT CAT TTG GGA GCA GAT   675
35    Ala Gly Asn Ser Asn Pro Leu Ile Asp His His Leu Gly Ala Asp   49

676   CCG TTT GCG CTG ACC TAT AAC GGA AGA GTC TAC ATC TAT ATG TCA   720
50    Pro Phe Ala Leu Thr Tyr Asn Gly Arg Val Tyr Ile Tyr Met Ser   64

721   AGT GAT GAC TAT GAA TAT AAT AGC AAC GGA ACG ATT AAG GAT AAC   765
65    Ser Asp Asp Tyr Glu Tyr Asn Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Asn   79

766   TCA TTT GCC AAT TTG AAT AGA GTA TTC GTC ATC TCT TCA GCG GAT   810
80    Ser Phe Ala Asn Leu Asn Arg Val Phe Val Ile Ser Ser Ala Asp   94

811   ATG GTG AAC TGG ACA GAC CAC GGA GCC ATT CCG GTA GCA GGT GCC   855
95    Met Val Asn Trp Thr Asp His Gly Ala Ile Pro Val Ala Gly Ala   109

856   AAC GGG GCT AAT GGC GGC CGG GGG ATT GCG AAA TGG GCA GGT GCG   900
110   Asn Gly Ala Asn Gly Gly Arg Gly Ile Ala Lys Trp Ala Gly Ala   124

901   TCC TGG GCC CCG TCA GTC GCA GTT AAA AAG ATA AAT GGT AAG GAT   945
125   Ser Trp Ala Pro Ser Val Ala Val Lys Lys Ile Asn Gly Lys Asp   139

946   AAA TTC TTC CTT TAT TTC GCA AAC AGC GGC GGA GGT ATC GGG GTT   990
140   Lys Phe Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Ser Gly Gly Gly Ile Gly Val   154

991   CTC ACC GCA GAC AGC CCG ATT GGC CCA TGG ACC GAC CCA ATC GGA   1035
155   Leu Thr Ala Asp Ser Pro Ile Gly Pro Trp Thr Asp Pro Ile Gly   169

1036  AAA GCG CTC GTA ACG CCA AGT ACG CCA GGA ATG TCC GGT GTT GTA   1080
170   Lys Ala Leu Val Thr Pro Ser Thr Pro Gly Met Ser Gly Val Val   184

1081  TGG CTT TTT GAT CCG GCA GTA TTT GTA GAT GAT GAC GGC ACC GGT   1125
185   Trp Leu Phe Asp Pro Ala Val Phe Val Asp Asp Asp Gly Thr Gly   199

1126  TAC CTG TAT GCC GGG GGA GGC GTT CCT GGC GGT TCA AAT CCA ACG   1170
200   Tyr Leu Tyr Ala Gly Gly Gly Val Pro Gly Gly Ser Asn Pro Thr   214

1171  CAG GGA CAA TGG GCC AAT CCT AAA ACA GCA AGA GTC ATG AAA TTG   1215
215   Gln Gly Gln Trp Ala Asn Pro Lys Thr Ala Arg Val Met Lys Leu   229

1216  GGG CCT GAT ATG ACC AGT GTT GTT GGA AGT GCA GCT ACA ATT GAT   1260
230   Gly Pro Asp Met Thr Ser Val Val Gly Ser Ala Ala Thr Ile Asp   244

1261  GCG CCT TTT ATG TTT GAA GAT TCG GGA ATG CAT AAG CAT AAC GGA   1305
245   Ala Pro Phe Met Phe Glu Asp Ser Gly Met His Lys His Asn Gly   259

1306  AAA TAT TAC TAT TCC TAT TGC ATC AAT TTC GGG GGC ACG CAC CCG   1350
260   Lys Tyr Tyr Tyr Ser Tyr Cys Ile Asn Phe Gly Gly Thr His Pro   274

1351  GCC GAT AAA CCC CCA GGT GAG ATC GGC TAT ATG ACC AGC TCA AGT   1395
275   Ala Asp Lys Pro Pro Gly Glu Ile Gly Tyr Met Thr Ser Ser Ser   289

1396  CCC ATG GGT CCC TTT ACA TAT AGA GGG CAC TTC CTG AAA AAT CCG   1440
290   Pro Met Gly Pro Phe Thr Tyr Arg Gly His Phe Leu Lys Asn Pro   304

1441  GGA GCA TTT TTC GGA GGT GGC GGA AAC AAC CAC CAT GCT GTT TTC   1485
305   Gly Ala Phe Phe Gly Gly Gly Gly Asn Asn His His Ala Val Phe   319

1486  AAT TTA AAA AAT GAG TGG TAT GTG GTG TAC CAT GCT CAA ACT GTC   1530
320   Asn Leu Lys Asn Glu Trp Tyr Val Val Tyr His Ala Gln Thr Val   334
 85

1531  AGT TCC GCT CTG TTC GGA GCC GGC AAA GGA TAC CGT TCT CCC CAT   1575
335   Ser Ser Ala Leu Phe Gly Ala Gly Lys Gly Tyr Arg Ser Pro His   349

1576  ATT AAT AAG CTG GTG CAT AAT GCA GAT GGA TCC ATT CAA GAG GTT   1620
350   Ile Asn Lys Leu Val His Asn Ala Asp Gly Ser Ile Gln Glu Val   364

1621  GCG GCA AAT TAT GCA GGC GTA ACA CAG CTT TCC AAT TTG AAT CCA   1665
365   Ala Ala Asn Tyr Ala Gly Val Thr Gln Leu Ser Asn Leu Asn Pro   379

1666  TTT AAC CGG GTA GAA GCT GAA ACG TTT GCC TGG AAT GGA CGC ATA   1710
380   Phe Asn Arg Val Glu Ala Glu Thr Phe Ala Trp Asn Gly Arg Ile   394

1711  TTG ACC GAG AAA TCT TCA GCA ACC GGC GGG CCG GTA AAT AAT CAA   1755
395   Leu Thr Glu Lys Ser Ser Ala Thr Gly Gly Pro Val Asn Asn Gln   409

1756  AAT GTA ACA AGC ATT CAT AAC GGA GAC TGG ATT GCT GTA GGA AAT   1800
410   Asn Val Thr Ser Ile His Asn Gly Asp Trp Ile Ala Val Gly Asn   424

1801  GCA GAC TTC GGG GCG GGC GGT GCC AGA ACG TTT AAA GCA AAT GTA   1845
425   Ala Asp Phe Gly Ala Gly Gly Ala Arg Thr Phe Lys Ala Asn Val   439

1846  GCA TCC ACT ATA GGC GGG AAA ATA GAA GTG CGT CTA GAC AGT GCA   1890
440   Ala Ser Thr Ile Gly Gly Lys Ile Glu Val Arg Leu Asp Ser Ala   454

1891  AAC GGT AAG CTT GCA GGA ACC CTG AAT GTA CCT TCC ACA GGC GGA   1935
455   Asn Gly Lys Leu Ala Gly Thr Leu Asn Val Pro Ser Thr Gly Gly   469

1936  GCG CAA ACC TGG AGA GAA ATA GAA ACT GCG GTA AGC GGT GCA ACC   1980
470   Ala Gln Thr Trp Arg Glu Ile Glu Thr Ala Val Ser Gly Ala Thr   484

1981  GGT GTA CAC AAA GTT TTC TTT GTA TTT ACC GGA ACA GGT ACA GGA   2025
485   Gly Val His Lys Val Phe Phe Val Phe Thr Gly Thr Gly Thr Gly   499

2026  AAC TTG TTT AAT TTT GAT TAC TGG CAG TTT ACG CAA AGA TAG CAG   2070
500   Asn Leu Phe Asn Phe Asp Tyr Trp Gln Phe Thr Gln Arg Stop        

2071  ATG AGA AAA CCT TTT GTT TGC AAT ATA AAA GGA GAC AGA TCA GAT   2115

Figura II.2.2: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen xynD
de Bacillus sp. BP-7.

93    AAA AGA CAA GGA GAG GAA AAA ATG ATT TCA AGC GTA AAA AAA CCA   137
                                  Met Ile Ser Ser Val Lys Lys Pro   7

138   ATT TGT GTA TTA TTG GTA TGT TTC ACT ATG CTG TCA GTC ATG TTA   182
8     Ile Cys Val Leu Leu Val Cys Phe Thr Met Leu Ser Val Met Leu   22

183   GCC GGG CCA GGT GCT ACT GAA GTT TTA GCA GCA AGT GAT GTA ACA   227
23    Ala Gly Pro Gly Ala Thr Glu Val Leu Ala Ala Ser Asp Val Thr   37

228   ATT AAT TTA TCT GCA GAA AAA CAA GTG ATC CGC GGT TTT GGA GGC   272
38    Ile Asn Leu Ser Ala Glu Lys Gln Val Ile Arg Gly Phe Gly Gly   52

273   ATG AAC CAC CCG GCT TGG ATT GGA GAT TTG ACA GCA GCT CAA AGA   317
53    Met Asn His Pro Ala Trp Ile Gly Asp Leu Thr Ala Ala Gln Arg   67

318   GAA ACC GCT TTT GGC AAT GGA CAG AAT CAG TTA GGT TTT TCA ATC   362
68    Glu Thr Ala Phe Gly Asn Gly Gln Asn Gln Leu Gly Phe Ser Ile   82

363   TTA AGA ATT CAT GTG GAT GAA AAT AGA AAT AAT TGG TAT AGA GAA   407
83    Leu Arg Ile His Val Asp Glu Asn Arg Asn Asn Trp Tyr Arg Glu   97

408   GTG GAG ACT GCA AAG AAT GCG ATC AAA CAT GGA GCA ATC GTT TTT   452
98    Val Glu Thr Ala Lys Asn Ala Ile Lys His Gly Ala Ile Val Phe   112
86
453   GCT TCT CCC TGG AAT CCT CCA AGC GAT ATG GTT GAG ACC TTC AAT   497
113   Ala Ser Pro Trp Asn Pro Pro Ser Asp Met Val Glu Thr Phe Asn   127

498   CGT AAT GGT GAC ACA TCA GCT AAA CGG CTA AGA TAC GAT AAG TAC   542
128   Arg Asn Gly Asp Thr Ser Ala Lys Arg Leu Arg Tyr Asp Lys Tyr   142

543   GCC GCA TAC GCG CAG CAT CTT AAC GAT TTT GTT ACC TAC ATG AAG   587
143   Ala Ala Tyr Ala Gln His Leu Asn Asp Phe Val Thr Tyr Met Lys   157

588   AAT AAT GGC GTG AAT CTT TAT GCG ATT TCT GTT CAA AAC GAG CCT   632
158   Asn Asn Gly Val Asn Leu Tyr Ala Ile Ser Val Gln Asn Glu Pro   172

633   GAT TAT GCA CAC GAA TGG ACG TGG TGG ACT CCG CAA GAA ATA CTT   677
173   Asp Tyr Ala His Glu Trp Thr Trp Trp Thr Pro Gln Glu Ile Leu   187

678   CGT TTC ATG AGA GAA AAT GCC GGT TCC ATT AAT GCA CGT GTC ATT   722
188   Arg Phe Met Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ile Asn Ala Arg Val Ile   202

723   GCA CCA GAA TCT TTT CAG TAC TTT AAA AAT ATA TCG GAC CCC ATT   767
203   Ala Pro Glu Ser Phe Gln Tyr Phe Lys Asn Ile Ser Asp Pro Ile   217

768   TTG AAC GAT CCA CAG GCG CTT AGG AAT ATG GAT ATT CTC GGA ACT   812
218   Leu Asn Asp Pro Gln Ala Leu Arg Asn Met Asp Ile Leu Gly Thr   232

813   CAC CTG TAC GGT ACT CAG GTC AGT CAG TTT CCT TAT CCT CTA TTC   857
233   His Leu Tyr Gly Thr Gln Val Ser Gln Phe Pro Tyr Pro Leu Phe   247

858   AAA CAA AAA GGA GCA GGG AAA GAG CTA TGG ATG ACG GAA GTA TAC   902
248   Lys Gln Lys Gly Ala Gly Lys Glu Leu Trp Met Thr Glu Val Tyr   262

903   TAT CCA AAC AGT GAC AAC AAT TCA GCG GAT CGC TGG CCC GAG GCA   947
263   Tyr Pro Asn Ser Asp Asn Asn Ser Ala Asp Arg Trp Pro Glu Ala   277

948   TTA GGC GTT TCA GAG CAT ATT CAC CAT TCA ATG GTG GAG GGA GAT   992
278   Leu Gly Val Ser Glu His Ile His His Ser Met Val Glu Gly Asp   292

993   TTT CAA TCT TAT GTT TGG TGG TAC ATC CGC AGA TCT TAC GGT CCT   1037
293   Phe Gln Ser Tyr Val Trp Trp Tyr Ile Arg Arg Ser Tyr Gly Pro   307

1038  ATG AAA GAA GAC GGT ACG ATC AGC AAA CGC GGT TAC AAT ATG GCT   1082
308   Met Lys Glu Asp Gly Thr Ile Ser Lys Arg Gly Tyr Asn Met Ala   322

1083  CAT TTC TCG AAG TTT GTG CGT CCC GGC TAT GTA AGG GTT GAT GCA   1127
323   His Phe Ser Lys Phe Val Arg Pro Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala   337

1128  ACG AAA AAT CCT AAT GCG AAC GTT TAC GTG TCA GCC TAT AAA GGT   1172
338   Thr Lys Asn Pro Asn Ala Asn Val Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Gly   352

1173  GAC AAC AAG GTC GTT ATT GTT GCC ATT AAC AAA AGC AAT ACA GGG   1217
353   Asp Asn Lys Val Val Ile Val Ala Ile Asn Lys Ser Asn Thr Gly   367

1218  GTC AAC CAA AAC TTT GTG TTG CAG AAT GGA TCT GCT TCT CAG GTA   1262
368   Val Asn Gln Asn Phe Val Leu Gln Asn Gly Ser Ala Ser Gln Val   382

1263  TCT AGG TGG ATA ACA AGC GGA AGC AGC AAT CTT CAA CCT GGA ACG   1307
383   Ser Arg Trp Ile Thr Ser Gly Ser Ser Asn Leu Gln Pro Gly Thr   397

1308  AAT CTC AAT GTA ACG GGC AAT CAT TTT TGG GCC CAT CTT CCA GCT   1352
398   Asn Leu Asn Val Thr Gly Asn His Phe Trp Ala His Leu Pro Ala   412

1353  CAA AGC GTG ACA ACA TTT GTC GCA AAT CGT TAA GGG GAC CTC AGG   1397
413   Gln Ser Val Thr Thr Phe Val Ala Asn Arg Stop                

1398  CAA GCG GGC CCG CGG ACA TGT TTT GCC AAA AAT CCA TAT AGC AAA   1442

Figura II.2.3: Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos del gen ynfF
de Bacillus sp. BP-7.
 87

También se encontró homología entre YnfF En primer lugar, los resultados de

(posiciones 103 a 365) y el dominio amplificación de ambos genes se clonaron de
conservado de las glicosil hidrolasas de la manera independiente en pUC19 usando la
familia 30 (GH 30) (65% de identidad), y con diana EcoRV (extremos romos), y se
módulos de unión a carbohidratos de la familia transformaron en E. coli 5K.
6 (CBM6) de Clostridium (70% de identidad). Tras la selección de transformantes
recombinantes (colonias blancas ampicilina
resistentes), el análisis por restricción de los
2.1.2. Aislamiento de los genes xynD e
plásmidos contenidos en ellos permitió la
ynfF de Bacillus sp. BP-7
selección de los plásmidos pUC19-xynD y
Con el fin de estudiar independientemente pUC19-ynfF, que contenían los genes xynD e
estos dos genes y caracterizar las enzimas ynfF respectivamente.
correspondientes, se procedió a amplificarlos y A continuación los plásmidos obtenidos se
clonarlos por separado. digirieron con SmaI y SacI para clonar de
Se diseñaron para ello cebadores que manera direccional los genes xynD e ynfF en
contenían las dianas SmaI y SacI, necesarias los vectores pMSR8amy y pMSR8SPO2,
para clonar cada uno de los genes en la bajo el control de los promotores contenidos
dirección adecuada dentro del polylinker de los en ellos.
vectores lanzadera E. coli - Bacillus subtilis Los nuevos plásmidos construidos se
pMSR8amy y pMSR8SPO2 (Figura II.2.4). transformaron en varias cepas huéspedes de
Estos vectores lanzadera se eligieron con el fin Escherichia coli (5K, HB101 y DH5α).
de poder sobreexpresar estas xilanasas en
cepas huéspedes de Bacillus subtilis, de En el caso de ynfF, entre los clones
manera que se facilitara su obtención en alta recombinantes obtenidos, se seleccionaron los
cantidad para su purificación así como para siguientes para poder realizar los estudios
ensayos papeleros. bioquímicos:

Cebador Secuencia Región de hibridación

SmaI Cadena - antes de la región de unión
FWXYND TGACCCGGGTGATCACCCCCC al ribosoma de xynD.
SacI Cadena + después del codón stop de
BKXYND TTGAGCTCTCTGATCTGTCTCC xynD.
SmaI Cadena - antes de la región de unión
FWYNFF TACCCGGGAAGACAAGGAGAGG al ribosoma de ynfF.
SacI Cadena + después del codón stop de
BKYNFF CTGAGCTCCCCTTAACGATTTG ynfF.

Figura II.2.4: Cebadores diseñados para la amplificación de la región estructural de los genes
xynD (FWXYND + BKYND) e ynfF (FWYNFF + BKYNFF).
88

– E. coli HB101/pMSR8amy-ynfF 9. Los geles revelados con tinción de Coomassie

– E. coli 5K/pMSR8SPO2-ynfF 1A. no mostraron diferencias significativas en el
– E. coli DH5α/pMSR8amy-ynfF 4. patrón de bandas proteicas del extracto celular
– E. coli DH5α/pMSR8SPO2-ynfF 50. del clon recombinante respecto al del control
Todos estos clones presentaron niveles negativo. Mientras que en los geles paralelos
similares de actividad sobre xilano de madera desarrollados como zimograma se observó una
de abedul (unas 0,004 U/ml de cultivo). banda intensa de actividad xilanasa
únicamente en el carril del extracto celular de
También se escogieron varios clones que E. coli DH5α/pMSR8amy-ynfF 4. Esta banda
contenían el gen xynD, aunque ninguno de los de actividad xilanasa mostró un peso
clones analizados mostró actividad xilanasa molecular aparente de unos 47 - 48 kDa, en
sobre xilano de madera de abedul. Este hecho concordancia con el peso molecular teórico
sugería que, tal como mostraban los estudios deducido previamente a partir de la secuencia.
de homología, el gen xynD codificaba una
arabinofuranosidasa en lugar de una xilanasa.

A B
kDa
2.2. Caracterización bioquímica
de la enzima YnfF de Bacillus sp. 150 -
100 -
BP-7
75 -
2.2.1. Determinación del peso
50 -
molecular.
Para confirmar de manera experimental el peso
molecular teórico de 47608,6 Da de YnfF, se 37 -

obtuvieron extractos celulares concentrados de

la cepa recombinante E. coli
DH5α/pMSR8amy-ynfF 4 y se analizaron 25 -
mediante electroforesis en geles de 15 -
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), junto a 1 2 1 2
los extractos celulares de un control negativo
Figura II.2.5: Análisis electroforético de la
(E. coli DH5α/pMSR8amy). Los geles de xilanasa YnfF mediante SDS-PAGE.
(A) Gel revelado con azul de Coomassie.
electroforesis resultantes fueron revelados con
(B) Zimograma de actividad xilanasa.
azul de Coomassie y mediante técnicas (1) Control –.
(2) Extractos concentrados de E. coli
zimográficas (Figura II.2.5). DH5α/pMSR8amy-ynfF 4.
 89

2.2.2. Propiedades enzimáticas más altos sobre xilano de madera de abedul

(0,581 U/g). Por el contrario, la enzima no
2.2.2.1. - Especificidad de sustrato presentó actividad detectable sobre xilanos de
Se hicieron estudios de especificidad de gramíneas (arabinoxilanos), y su actividad
sustrato ensayando la actividad de extractos tampoco fue detectable o significativa sobre
crudos de los clones recombinantes de E. coli los aril-glicósidos ensayados.
conteniendo el gen ynfF sobre diferentes
xilanos, celulosas y otros polisacáridos,
2.2.2.2. - pH óptimo y Temperatura óptima
además de sobre aril-xilósidos y otros
aril-glicósidos. Se determinaron las condiciones óptimas en
Los resultados obtenidos (Tabla II.2.2) cuanto a pH y temperatura para la actividad de
mostraron que la xilanasa YnfF tenía actividad YnfF sobre xilano de madera de abedul.
sobre xilanos de maderas duras (tales como
xilano de madera de abedul, de haya y metil Para ello se ensayó la actividad xilanasa de
glucuronoxilano), obteniéndose los valores extractos crudos de los clones recombinantes

Tabla II.2.2: Especificidad de sustrato de la xilanasa YnfF.

Actividad % respecto a la
específica actividad específica
Sustrato (U/g) a máxima
Xilano de madera de abedul 0,581 100,0
Xilano de madera de haya 0,464 79,9
Metil glucuronoxilano 0,573 98,7
Xilano de espelta de avena ND 0
Arabinoxilano de trigo ND 0
Arabinoxilano de centeno ND 0
Carboximetil celulosa ND 0
Avicel ND 0
Laminarina ND 0
Liquenano ND 0
Poligalacturonato ND 0
Pectina ND 0
Almidón ND 0
pNPX 0,001 0,2
oNPX ND 0
pNPG ND 0
pNPAp ND 0
pNPAf ND 0

a
ND: No Detectable
 90

de E. coli conteniendo el gen ynfF sobre xilano 100

de madera de abedul en el rango de pH de 3 a

Actividad relativa (%)

80
12 en intervalos de 0,5 unidades de pH, a una
temperatura de 65 ºC. 60
A partir de estos ensayos se observó que el pH
40
óptimo de XynA en extractos crudos es de 6,5,
presentando más de un 50% de actividad en el 20

rango de pH entre 4,5 y 10 (Figura II.2.6).

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Temperatura (ºC)
100

Figura II.2.7: Efecto de la temperatura sobre la

Actividad relativa (%)

80
actividad de YnfF.
60

aplicación en procesos industriales, los

40
extractos crudos de de los clones
20
recombinantes de E. coli conteniendo el gen
0 ynfF se incubaron a 50, 55 ó 60 ºC durante
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
diferentes intervalos de tiempo hasta un
pH
máximo de 3 h, a pH 7. A continuación se
Figura II.2.6: Efecto del pH sobre la actividad de ensayó la actividad xilanasa residual sobre
YnfF.
xilano de madera de abedul (Figura II.2.8).

150
Se midió también la actividad de estos 50 ºC

extractos, a pH 7 y 6,5, en el rango de 125 55 ºC

Actividad relativa (%)

temperaturas de 30 a 75 ºC, en intervalos de 100

60 ºC
5 ºC. 75
Los ensayos permitieron determinar que la
50
temperatura óptima de YnfF en extractos
25
crudos es de 65 ºC, presentando más de un
0
60% de actividad en el rango de temperaturas 30 60 90 120 150 180
comprendido entre 30 y 70 ºC (Figura II.2.7). Tiempo de preincubación (min.)

Figura II.2.8: Termorresistencia de YnfF a

pH 7.
2.2.2.3. - Termorresistencia
Para analizar la termoestabilidad de la enzima
YnfF, factor importante para una posible
 91

La xilanasa cruda se mostró altamente estable Se realizaron también ensayos de actividad

a las 3 temperaturas ensayadas, alcanzando xilanasa añadiendo EDTA (1 y 10 mM), y una
incluso valores superiores al 100% de su muestra sin adicionar ningún catión
actividad tras las 3 h de incubación ensayadas, (Control +).
lo que hace suponer un proceso de activación
por temperatura.
Tal como se observa en la Figura II.2.9, en
Los valores de actividad relativa fueron
general la xilanasa YnfF mostró únicamente
significativamente superiores en el caso de las
una ligera inhibición por casi todos los
incubaciones a 50 ºC.
cationes a concentraciones de 1 mM.
Sin embargo, a concentraciones de 10 mM, el

2.2.2.4. - Influencia de iones metálicos sobre grado de inhibición por algunos cationes tales

la actividad como Fe3+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ y Mn2+ fue

importante (7 - 29% de la actividad residual);
Por último, se comprobó la influencia de
mientras que para el resto de cationes la
diferentes cationes metálicos sobre la actividad
actividad residual se mantuvo superior al 80%.
de la xilanasa YnfF.
Por otro lado, la adición de EDTA no modificó
Para ello, se realizaron ensayos de actividad
de forma significativa la actividad de la
xilanasa en presencia de diferentes cationes
enzima.
metálicos a concentraciones finales de 1 mM y
10 mM.

1 mM 10 mM
100
Actividad Relativa (%)

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
EDTA
Mg2+
Mn2+

Cu2+

Pb2+

Hg2+
NH4+

Co2+

C+
Ni2+

Zn2+

Ag2+
Ca2+
Fe3+

Ba2+

Figura II.2.9: Influencia de diferentes iones y EDTA a 1 y 10 mM sobre la actividad de YnfF.

CAPÍTULO III.
ESTUDIO DE LA XILANASA XYNB DE

PAENIBACILLUS BARCINONENSIS
 95

1. - INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 2. - RESULTADOS

La xilanasa B (también denominada X20 o
XynB) de Paenibacillus barcinonensis 2.1. Especificidad de sustrato de
(previamente descrito como Bacillus sp. XynB de Paenibacillus
BP-23) había sido clonada en Escherichia coli barcinonensis
y caracterizada previamente por el grupo de Tal como se ha comentado, la xilanasa XynB
investigación. Esta xilanasa presenta una de Paenibacillus barcinonensis, además de
inusual actividad sobre aril-xilósidos, así como actividad xilanasa, presenta una elevada
actividad transxilosidasa (Blanco et al., 1996), actividad sobre aril-xilósidos.
lo cual la convierte en una enzima de interés Con el fin de dilucidar mejor la especificidad
tanto a nivel de ciencia básica como a nivel de sustrato de esta enzima, se obtuvieron
biotecnológico. extractos celulares concentrados del clon
E. coli 5K/pX60, derivado del clon original
Un factor importante a la hora de facilitar la E. coli 5K/pX20 (Blanco et al., 1996), y se
aplicación de enzimas es la obtención de cepas ensayó su actividad enzimática sobre
productoras que expresen y secreten las diferentes xilanos, otros polisacáridos,
enzimas en cantidades elevadas. Estas cepas aril-xilósidos y otros aril-glicósidos, todos
también resultan de interés para obtener ellos al 0,5%, a excepción de los
cantidades suficientes de enzimas para su aril-glicósidos, que se ensayaron al 0,1%.
adecuado estudio bioquímico y estructural.
De esta manera, los objetivos de este capítulo Los resultados (Tabla III.2.1) mostraron que
fueron: XynB presenta similar actividad específica
- El análisis detallado de la especificidad de sobre los diferentes xilanos ensayados,
sustrato de la xilanasa B de Paenibacillus independientemente de su grado y tipo de
barcinonensis. sustituciones. De entre éstos, la máxima
- La clonación de la xilanasa B de actividad se obtuvo sobre arabinoxilano de
Paenibacillus barcinonensis en vectores trigo (265,4 U/g). La enzima también presentó
lanzadera E. coli - Bacillus subtilis para su actividad sobre todos los aril-glicósidos
posterior transformación en cepas ensayados, resultando destacable su actividad
huéspedes de Bacillus subtilis. sobre aril-xilósidos, siendo ésta igual o incluso
- El estudio de la sobreexpresión en los superior a su actividad sobre xilanos. En
clones recombinantes de Bacillus subtilis concreto, la actividad específica sobre oNPX
obtenidos. (550,3 U/g) fue aproximadamente el doble que
la obtenida sobre arabinoxilano de trigo.
96

Tabla III.2.1: Especificidad de sustrato de XynB en extractos crudos de E. coli 5K/pX60.

Actividad % respecto a la
específica actividad específica
Sustrato (U/g) a máxima
Xilano de madera de abedul 215,0 39,07
Xilano de madera de haya 248,7 45,18
Meti glucuronoxilano 169,6 30,82
Xilano de espelta de avena 213,1 38,72
Arabinoxilano de trigo 265,4 48,23
Arabinoxilano de centeno 224,4 40,77
Carboximetil celulosa 3,1 0,56
Avicel 3,5 0,63
Laminarina ND 0
Liquenano ND 0
Almidón ND 0
pNPX 286,1 51,98
oNPX 550,3 100,00
pNPG 0,6 0,11
pNPG2 41,5 7,53
pNPG3 42,5 7,72
pNPG4 42,1 7,66
pNPG5 31,4 5,70
pNAp 26,4 4,80
pNAf 0,8 0,14

a
ND: No Detectable

Los resultados obtenidos corroboran los 2.2. Producción de XynB de

previamente publicados (Blanco et al., 1996) y
podrían indicar que XynB es una β-xilosidasa
(β-1,4-xylosidases, EC 3.2.1.37) en lugar de
una xilanasa. Sin embargo, su incapacidad
para hidrolizar la xilobiosa tal como se había
demostrado en trabajos previos (Blanco et al.,
1996) descartan esta interpretación.
Paenibacillus barcinonensis en
huéspedes homólogos
2.2.1. Clonación en vectores lanzadera
E. coli-Bacillus subtilis
2.2.1.1. - Amplificación de xynB para su
clonación en Escherichia coli
La xilanasa B es una enzima de dominio único
de 332 aminoácidos, con un peso molecular
teórico de 38561 Da. Está codificada por una
pauta abierta de lectura (ORF) de 999 bp
 97

contenida en la secuencia depositada en el Los 3 cebadores que se diseñaron a tal efecto

EMBL-Bank con número de acceso pueden verse en la Figura III.2.1.
AJ006646.
Para clonar el gen xynB de Paenibacillus El resultado de amplificación con los
barcinonensis en E. coli, en primer lugar se cebadores FWX20A y BKX20 fue, tal como se
amplificó el gen xynB a partir del ADN esperaba, un fragmento de 1,3 kb
plasmídico de pX60. Se diseñaron para ello correspondiente a la hipotética región
cebadores que contenían las dianas SacI y promotora (de 121 bp) más la región
SmaI, necesarias para clonar el gen en la estructural de xynB. Este fragmento se clonó
dirección adecuada dentro del polylinker de los en el vector lanzadera pN5, entre las dianas
plásmidos pN5 y pRBSPO2; vectores SacI y SmaI, dando lugar al vector pN5X20.
lanzadera E. coli - Bacillus subtilis De la amplificación con los cebadores
previamente construidos en el grupo de FWX20B y BKX20 resultó un fragmento de
investigación. 1,1 kb (tamaño esperado) correspondiente a la
Además, puesto que se quería evaluar la región de unión al ribosoma más la región
expresión de xynB tanto bajo el control de su estructural de xynB. Este fragmento se clonó
propio promotor como bajo el control del en el vector lanzadera pRBSPO2, entre las
promotor fuerte SPO2, contenido en el vector dianas SacI y SmaI, bajo el control del
pRBSPO2, se amplificó el gen promotor SPO2, dando lugar al plásmido
alternativamente con y sin su promotor. pBRSPO2X20.

EcoRI (314)
EcoRI (100) PstI (303) PstI (1020)

ORF

pX60

FWX20A FWX20B BKX20

Cebador Secuencia
Región de hibridación
SacI Cadena - después de la pauta
BKX20 ACGAGCTCTCCCTTAATCAAGGGC abierta de lectura de xynB.
SmaI Cadena + antes de la hipotética
FWX20A CGCCCGGGTTTTCCCAGTCAC región promotora de xynB.
Cadena + después de la
SmaI
FWX20B AACCCGGGAGGAGGAACCAGG hipotética región promotora de
xynB.
Figura III.2.1: Cebadores diseñados para la amplificación de xynB con su posible promotor
(FWX20A + BKX20) y sin él (FWX20B + BKX20).
98

Los plásmidos construidos fueron 2.2.1.2. - Transformación en las cepas de

transformados en diferentes cepas de E. coli y Bacillus subtilis MB216 y MW15
de entre todos los clones obtenidos se Las cepas huéspedes Bacillus subtilis MB216
escogieron aquellos que presentaban actividad y Bacillus subtilis MW15, esta última
xilanasa en placas de agar LB suplementado deficiente en xilanasas, celulasas y proteasas,
con xilano-RBB. se transformaron con los plásmidos
Se obtuvo ADN plasmídico de los clones pRBSPO2X20 y pN5X20.
seleccionados y se realizaron análisis de Los transformantes obtenidos se seleccionaron
restricción y secuenciación para verificar las en placas de agar DM3 suplementadas con
construcciones genéticas que contenían. cloramfenicol 20 µg/ml, para los
transformantes de la cepa MB216, o
A partir de estos análisis se escogió un clon de
cloramfenicol 50 µg/ml, para los de la cepa
E. coli HB101/pRBSPO2X20 y un clon de
MW15.
E. coli XL1-Blue/pN5X20, por presentar el
De entre todos los clones obtenidos se
primero de ellos xynB sin promotor propio en
seleccionaron aquellos que presentaban
pRBSPO2 (pRBSPO2X20), y xynB con su
actividad xilanasa en placas de agar LB con
promotor en pN5 (pN5X20) el segundo de
xilano-RBB. El análisis de restricción del
ellos.
ADN plasmídico de los clones seleccionados
reveló que contenían las construcciones
Se hizo a continuación una cuantificación de
correctas (pN5X20 y pRBSPO2X20).
actividad xilanasa en los extractos celulares de
los clones elegidos. Los resultados se muestran
Como resultado de la transformación de las 2
en la Tabla III.2.2.
construcciones en cada una de las 2 cepas de

Tabla III.2.2: Actividad xilanasa de los clones Bacillus subtilis se obtuvieron 4 cepas
recombinantes elegidos. recombinantes:
Actividad Actividad – B. subtilis MW15/pN5X20
xilanasa xilanasa
Clones en placa (U/ml cultivo) – B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
E. coli HB101/ – B. subtilis MB216/pN5X20
+ 0,04
pRBSPO2X20 – B. subtilis MB216/pRBSPO2X20
E. coli XL1-Blue/
+ 0,08
pN5X20
E. coli 5K/
+ 0,08
pX60 (C +)
E.coli/
- 0,00
pUC19 (C -)
 99

2.2.2. Expresión en Bacillus subtilis En vista de estos resultados se decidió

2.2.2.1. - Análisis de expresión de la xilanasa
en las cepas recombinantes de Bacillus
subtilis
Las cepas recombinantes de B. subtilis se
cultivaron en caldo nutritivo a 30 ºC durante
varios días, se tomaron muestras a distintos
días de cultivo, y se determinó la actividad
xilanasa en los sobrenadantes de los cultivos.
Los resultados se resumen en la Tabla III.2.3 y
en la Figura III.2.2.
proseguir los estudios de producción con la
cepa B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, por ser
la que presentaba los valores más elevados de
actividad xilanasa.
Para comprobar la correcta expresión de XynB
en la cepa seleccionada, se hicieron análisis
electroforéticos en geles de poliacrilamida con
SDS de las proteínas de sobrenadantes de
cultivo de dicha cepa.

Tabla III.2.3: Actividad xilanasa en los sobrenadantes de cultivos de los clones recombinantes de Bacillus
subtilis.
Actividad (U/ml de sobrenadante)
Cepa 1 día 2 días 3 días 4 días 8 días
MB216/pN5X20 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
MB216/pRBSPO2X20 0,01 0,03 0,03 0,02 0,02
MB216 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
MW15/pN5X20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
MW15/pRBSPO2X20 0,00 0,02 0,05 0,05 0,04
MW15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,06
Actividad xilanasa (U/ml)

0,05
MB216/pN5X20
0,04
MB216/pRBSPO2X20
MB216
0,03
MW15/pN5X20
MW15/pRBSPO2X20
0,02 MW15

0,01

0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Días
Figura III.2.2: Actividad xilanasa en los sobrenadantes de cultivos de los clones recombinantes de Bacillus
subtilis.
100

En estos sobrenadantes de B. subtilis eficacia en producción y secreción de la

MW15/pRBSPO2X20 se observó una banda misma.
de proteína que no aparecía en el sobrenadante
del control – (B. subtilis MW15/pRBSPO2) y
2.2.2.2. - Expresión en diferentes medios de
que mostraba la misma movilidad
cultivo
electroforética que una banda proteica de los
extractos del clon original E. coli 5K/pX20 Para ensayar la influencia de la composición

utilizado como control + (Figura III.2.3). Esta del medio de cultivo sobre la producción de

banda mostraba un tamaño de unos 38 kDa, xilanasa por parte de B. subtilis

que concuerda con el tamaño descrito para la MW15/pRBSPO2X20, se realizaron cultivos

xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis de dicha cepa durante 8 días a 30 ºC en 4

(Blanco et al., 1996), correspondiendo por medios distintos (caldo nutritivo, MG, MG2 y

tanto a la misma. BREC1), sin suplementar o suplementados con

diferentes sustancias, y se determinó la
kDa
actividad xilanasa en los sobrenadantes de
116 -
97 - dichos cultivos a diferentes tiempos durante el
periodo de incubación.
66 - Debido a la gran cantidad de sustancias
reductoras del medio, la actividad xilanasa de
45 -
31 - los sobrenadantes de los medios MG y BREC1
y de algunas muestras en medios MG2 no
21 - pudo cuantificarse por el método de
Nelson-Somogyi, y hubo que evaluarla por el
método cromogénico basado en xilano-RBB.
1 2 3 4
Esto hace que los resultados obtenidos no sean
Figura III.2.3: Análisis por SDS-PAGE en geles
del 12%. del todo comparables, ya que los valores de
(1) Extracto de E. coli 5K/pBR322 (C -). actividad obtenidos por dicho método
(2) Extracto de E. coli 5K/pX20.
(3) Sobrenadante de cultivos de 4 días en caldo presentan mayor variabilidad y acostumbran a
nutritivo de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.
(4) Sobrenadante de cultivos de 4 días en caldo
ser algo mayores que los obtenidos por el
nutritivo de B. subtilis MW15/pRBSPO2 (C -). método de Nelson-Somogyi.

Los resultados más significativos obtenidos

Es de destacar también que la xilanasa B
con los medios utilizados se resumen en la
constituía la proteína mayoritaria de los
Tabla III.2.4.
sobrenadantes de la nueva cepa B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, hecho que evidencia la
 101

Tabla III.2.4: Producción de xilanasa por B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 en distintos medios de cultivo.

Día de máxima Máxima actividad

Medio base Sustancia añadida actividad (U/ml sobrenadante)
- 4 0,06
Caldo Xilano de espelta de avena 1% 3 0,09
nutritivo Paja de arroz 1% 4 0,20
Xilano de madera de abedul 0,2% 3 0,23
- 8 0,12 (a)
MG Xilano de espelta de avena 1% 8 0,16 (a)
Paja de arroz 1% 8 0,16 (a)
- 0,00
MG2 Xilano de espelta de avena 1% 3 0,09 (a)
Paja de arroz 1% 8 0,13 (a)
- 0,00 (a)
BREC1 Xilano de espelta de avena 1% 8 0,15 (a)
Paja de arroz 1% 4 0,07 (a)
(a)
: Valores obtenidos por el método cromogénico basado en xilano-RBB.

Se observó que la máxima producción tuvo MW15/pRBSPO2X20 correspondientes a los

lugar en caldo nutritivo suplementado con
xilano de madera de abedul a los 3 días de
cultivo.
Se hicieron también análisis de proteínas de
los sobrenadantes de los cultivos anteriores
mediante electroforesis en geles
poliacrilamida con SDS, observándose en
todos los casos la banda proteica de 38 kDa
correspondiente a XynB, muy intensa y
ausente en los controles negativos (datos no
mostrados).
sobrenadantes de los cultivos en los diferentes
medios ensayados, y se hicieron
determinaciones de actividad xilanasa para
medir la proporción de xilanasa existente
dentro de la célula.
Al comparar la actividad en los extractos
de celulares (intracelular) con la actividad en los
sobrenadantes de cultivo (extracelular) se
observó que sorprendentemente la actividad
intracelular suponía más del 35% del total,
valor muy superior a lo esperado inicialmente
(Tabla III.2.5).

A continuación, se hicieron análisis

2.3. Localización celular de XynB electroforéticos de las proteínas de los
extractos celulares y sobrenadantes de cultivos
2.3.1. Localización de XynB en Bacillus
de 3 y 4 días de B. subtilis
subtilis MW15/pRBSPO2X20
MW15/pRBSPO2X20 en caldo nutritivo.
Se obtuvieron los extractos celulares de las
Tanto en los extractos celulares como en los
muestras de Bacillus subtilis
sobrenadantes se observó la banda proteica de
102

Tabla III.2.5: Actividad xilanasa en sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de Bacillus

subtilis MW15/pRBSPO2X20.

B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 Actividad Proporción

(4º día de incubación) (U/ml de cultivo) (%)
Extracto celular 0,03 37,5
Caldo nutritivo
Sobrenadante 0,05 62,5
Caldo nutritivo con Extracto celular 0,11 35,5
paja de arroz 1% Sobrenadante 0,20 64,5

38 kDa correspondiente a XynB planteáramos como nuevo objetivo el estudio

(Figura III.2.4). Además, la intensidad de de la localización celular de XynB en la cepa
dicha banda proteica era aproximadamente la original Paenibacillus barcinonensis.
misma tanto en extractos celulares como en
muestras de sobrenadantes.
2.3.2. Localización de XynB en
Paenibacillus barcinonensis
La proporción tan elevada de xilanasa B
intracelular, cuando la enzima se expresaba en Para determinar la localización celular de la

cepas secretoras de Bacillus subtilis, fue un xilanasa B en la cepa original Paenibacillus

resultado inesperado que hizo que nos barcinonensis, se hicieron nuevos cultivos en
caldo nutritivo suplementado con xilano de

kDa

116 -
97 -

66 -

45 -
31 -

21 -

1 2 1 2 1 2 1 2
Sobrenadantes Extractos Sobrenadantes Extractos

3er día de cultivo 4º día de cultivo

Figura III.2.4: Análisis mediante SDS-PAGE en geles del 12% de los sobrenadantes y extractos celulares
de cultivos de (1) B. subtilis MW15/pRBSPO2 (C-) y (2) B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.
 103

madera de abedul 0,2%, de Paenibacillus mayoritaria en los sobrenadantes (Tabla III.2.6

barcinonensis y de la cepa recombinante y Figura III.2.5).
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20. En los
extractos celulares y sobrenadantes de estos Los resultados obtenidos hasta este punto
cultivos se determinaron tanto la actividad parecían indicar que la xilanasa B era una
xilanasa (sobre xilano) como la actividad enzima de localización preferentemente
xilosidasa (sobre pNPX), por ser XynB activa intracelular. Para determinar si la existencia de
sobre ambos sustratos (Blanco et al., 1996). lisis celular en los cultivos realizados daba
lugar a la liberación inespecífica de XynB a
En el caso de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 los sobrenadantes de cultivo, y por tanto era
no se detectaron valores significativos de responsable de la actividad xilanasa detectada
actividad xilanasa ni xilosidasa en los extracelularmente, se realizaron ensayos que
sobrenadantes hasta las 24 h de cultivo, evaluaban el grado de lisis celular en los
mientras que en los extractos celulares se cultivos y su relación con los niveles de XynB
detectaron ambas actividades a las 17 h de en los sobrenadantes.
cultivo. Las actividades enzimáticas en los Una de las enzimas usada comúnmente como
extractos celulares fueron muy superiores a las marcador intracelular en Bacillus subtilis es la
encontradas en los sobrenadantes hasta las isocitrato deshidrogenasa (ICDH). Sin
48 h de cultivo, momento en que embargo en los ensayos realizados únicamente
aproximadamente ambas actividades se se pudo detectar actividad ICDH, aunque a
igualaron. Únicamente en cultivos de 72 h las unos niveles muy bajos, en algunas muestras
actividades extracelulares xilanasa y xilosidasa de los extractos celulares de B. subtilis
superaron ligeramente a las intracelulares MW15/pRBSPO2X20, pero no en los
(Tabla III.2.6 y Figura III.2.5). sobrenadantes de cultivo.

En el caso de Paenibacillus barcinonensis, Se realizaron entonces ensayos para

cepa que posee un sistema xilanolítico
complejo con varios enzimas con actividad
xilanasa y xilosidasa, se observó que los
valores de actividad xilanasa fueron siempre
mucho mayores en los sobrenadantes. Sin
embargo, la actividad xilosidasa, asociada
principalmente a XynB, era mayoritariamente
intracelular en cultivos jóvenes (14 h), y sólo a
las 48 h pasaba a localizarse de forma
determinar la presencia de otro marcador
intracelular, la malato deshidrogenasa (MDH),
que a pesar de no estar descrito como tal en
Bacillus subtilis es muy usado como marcador
intracelular en E. coli.
En estos ensayos, se detecto actividad MDH
tanto en extractos como en sobrenadantes de
cultivos de 1 a 3 días de B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20. Los valores de
104

Tabla III.2.6: Actividad xilanasa y xilosidasa total en sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de
Paenibacillus barcinonensis y Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.

Actividad xilanasa Actividad (U/ml cultivo) Porcentajes (% actividad)

14 17 24 48 72 14 17 24 48 72
Paenibacillus Extracto 0,040 - 0,035 0,051 0,052 26,2 - 6,3 5,7 6,0
barcinonensis Sobrenadante 0,113 - 0,514 0,850 0,821 73,8 - 93,7 94,3 94,0
B. subtilis MW15/ Extracto - 0,005 0,084 0,172 0,215 - 100,0 93,9 55,3 48,4
pRBSPO2X20 Sobrenadante - 0,000 0,005 0,139 0,229 - 0,0 6,1 44,7 51,6

Actividad xilosidasa Actividad (U/ml cultivo) Porcentajes (% actividad)

14 17 24 48 72 14 17 24 48 72
Paenibacillus Extracto 0,017 - 0,013 0,011 0,010 100,0 - 48,3 28,5 31,8
barcinonensis Sobrenadante 0,000 - 0,013 0,027 0,021 0,0 - 51,7 71,5 68,2
B. subtilis MW15/ Extracto - 0,005 0,058 0,353 0,283 - 100,0 69,9 56,7 43,6
pRBSPO2X20 Sobrenadante - 0,000 0,025 0,270 0,366 - 0,0 30,1 43,3 56,4

Actividad Xilanasa:
Paenibacillus
Paenibacillus sp. BP23
barcinonensis B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
0,90 1,20 0,25 1,00
0,80 0,90
1,00
0,70 0,20 0,80
0,60 0,80 0,70
U/ml cultivo

U/ml cultivo
D.O.600nm

D.O.600nm
0,15 0,60
0,50
0,60 0,50
0,40
0,10 0,40
0,30 0,40 0,30
0,20 0,05 0,20
0,20
0,10 0,10
0,00 0,00 0,00 0,00
0 24 48 72 0 24 48 72
Horas Horas
Extractos Sobrenadantes D.O.600nm Extractos Sobrenadantes D.O.600nm

Actividad Xilosidasa:
Paenibacillus
Paenibacillus sp. BP23
barcinonensis B. subtilis MW15/pRBSPO2X20
0,03 1,20 0,40 1,00
0,35 0,90
0,03 1,00
0,80
0,30
0,02 0,80 0,70
U/ml cultivo

U/ml cultivo

0,25
D.O.600nm
D.O.600nm

0,60
0,02 0,60 0,20 0,50
0,15 0,40
0,01 0,40 0,30
0,10
0,01 0,20 0,20
0,05 0,10
0,00 0,00 0,00 0,00
0 24 48 72 0 24 48 72
Horas Horas
Extractos Sobrenadantes D.O.600nm Extractos Sobrenadantes D.O.600nm

Figura III.2.5: Actividad xilanasa y xilosidasa en extractos celulares y sobrenadantes de cultivos de

Paenibacillus barcinonensis y Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20.
 105

actividad de este marcador de lisis celular xilanasa de secreción previamente clonada y

obtenidos presentaron bastante correlación con caracterizada (Blanco et al., 1999): extractos
los valores de actividad xilanasa detectados en de E. coli 5K/pX20 como control + de XynB,
los compartimentos intracelular y extracelular y extractos de E. coli 5K/pX31 como
de la cepa recombinante (Tabla III.2.7). control + de XynC. (Figura III.2.6).
Por el contrario, no pudo detectarse actividad
MDH ni en extractos ni en sobrenadantes de
cultivos de Paenibacillus barcinonensis.

Ante la falta de resultados concluyentes

utilizando los marcadores intracelulares para
Paenibacillus barcinonensis, con el fin de
comprobar la localización intracelular de
XynB en dicha cepa, se realizaron análisis
zimográficos de extractos y sobrenadantes
concentrados tanto de cultivos jóvenes (17 h)
como de cultivos en fase estacionaria (72 h).
Puesto que la xilanasa B de Paenibacillus
barcinonensis se inactiva de manera
irreversible en geles desnaturalizantes
(SDS-PAGE), se tuvieron que usar geles
nativos para su posterior revelado zimográfico.
Además, se usaron 2 controles para identificar
tanto la xilanasa B, en estudio, como la
xilanasa C de Paenibacillus barcinonensis,
1 2 3 4 5 6
Figura III.2.6: Análisis zimográfico de
sobrenadantes y extractos celulares de cultivos de
Paenibacillus barcinonensis en caldo nutritivo.
(1) Sobrenadante de cultivos de 17 h.
(2) Extractos celulares de cultivos de 17 h.
(3) Sobrenadante de cultivos de 72 h.
(4) Extractos celulares de cultivos de 72 h.
(5) Extractos celulares de E. coli 5K/pX20 (C + de
XynB).
(6) Extractos celulares de E. coli 5K/pX31 (C + de
XynC).

Tabla III.2.7: Actividad MDH y xilanasa en fracciones celulares de B. subtilis MW15/pRBSPO2X20.

Actividad MDH Actividad MDH Actividad xilanasa

(U/ml cultivo) extracelular (%) extracelular (%)
1 día de Extractos 0,039
4,88 30,1
cultivo Sobrenadantes 0,002
2 días de Extractos 0,084
72,10 43,3
cultivo Sobrenadantes 0,218
3 días de Extractos 0,013
83,33 56,4
cultivo Sobrenadantes 0,065
Control - 0,000
106

En los carriles correspondientes a los membranas. Los extractos celulares se

sobrenadantes concentrados de Paenibacillus centrifugaron a 38000xg durante 1 h a 4 ºC y
barcinonensis, tanto a 17 como a 72 h, se se recuperaron los sobrenadantes (citoplasma),
observó una banda de actividad muy mientras que los sedimentos (pellet, restos de
prominente correspondiente a la xilanasa C, pared y membranas celulares) se lavaron con
juntamente con otras bandas difusas y menos tampón acetato y se resuspendieron en 1
intensas. Todas estas bandas correspondían al volumen del mismo tampón.
complejo de xilanasas secretadas de Tras este fraccionamiento, se ensayó la
Paenibacillus barcinonensis, previamente actividad xilanasa tanto en la fracción soluble
descrito (Blanco et al. 1993, 1995). Sin como en la fracción particulada del extracto
embargo, en estos sobrenadantes, no se celular de Paenibacillus barcinonensis.
observó ninguna banda de actividad con la Tal como puede observarse en los resultados
movilidad electroforética de la xilanasa B. de la Tabla III.2.8, sólo se detectó actividad
Por el contrario, en los carriles xilanasa en el citoplasma (sobrenadante),
correspondientes a los extractos celulares se mientras que no se detecto actividad en la
observaba claramente una banda de actividad fracción particulada.
correspondiente a la la xilanasa B, tanto en los Tabla III.2.8: Actividad xilanasa en fracciones
cultivos jóvenes de 17 h como en los de fase celulares de Paenibacillus barcinonensis.

estacionaria de 72 h. Actividad xilanasa

En zimogramas de otras muestras de cultivos Fracción (U/ml cultivo) a
Citoplasma 0,080
de Paenibacillus barcinonensis
Pared y membranas
correspondientes a 17 y 72 h, se observaron ND
celulares
a
ocasionalmente bandas de actividad ND: No Detectable

correspondientes a XynB en algunos

sobrenadantes, aunque siempre mucho más
tenues que las correspondientes bandas de
actividad de XynB observadas en todos los
extractos celulares.
Para evaluar la posibilidad de que XynB fuera
una enzima de secreción pero asociada a la
pared bacteriana, se realizó un fraccionamiento
fino de extractos celulares de cultivos de 14 h
de Paenibacillus barcinonensis para separar el
citoplasma de los restos de
2.3.3. Análisis de péptido señal
Los resultados observados indicaban que
XynB de Paenibacillus barcinonensis era una
xilanasa intracelular en lugar de una enzima de
secreción. Por ello, se realizó un análisis del
gen codificante para determinar la existencia o
no de señales de secreción en él.
El estudio de la secuencia de la región
N-terminal de XynB no reveló la presencia de
pared y secuencias de aminoácidos compatibles con la
 107

estructura típica de un péptido señal que celulares como de sobrenadantes de cultivo de

pudiera ser reconocido por los sistemas de B. subtilis MW15/pRBSPOX20. También se
secreción de Bacillus subtilis y otros Gram +. secuenció el extremo N-terminal de la proteína
La ausencia de péptido señal en XynB fue aislada a partir de extractos celulares del clon
confirmada por los análisis realizados con los original E. coli/pX20.
programas SignalP y PSort, en contraposición En los 3 casos, la secuencia N-terminal que se
con los de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7, obtuvo fue la misma, STEIPSLSAS, y
utilizada como control + por contener un coincidía con la secuencia N-terminal
péptido señal típico (Figura III.2.7). deducida a partir de la secuencia de
nucleótidos. Este resultado confirma la
Para confirmar la ausencia de péptido señal, se ausencia de péptido señal en XynB y
secuenció el extremo N-terminal de la corrobora que la presencia de XynB en el
xilanasa B aislada a partir de geles de medio de cultivo sería debida a una liberación
poliacrilamida de muestras tanto de extractos inespecífica, posiblemente por lisis celular.

XynA de Bacillus sp. BP-7 (C+) XynB de Paenibacillus barcinonensis

MFKFTKKFLVGLTAALMSI SLFSANASAANTDYWQNWT MSTEI PSLSASYANSFKI GAAVHTRMLQTEGEFI AKHY

DGGGTVNAVNGSGGNYSVNWSNTGNFVVGKGWTTGSPF NSVTAENQMKFEEVHPREHEYTFEAADEI VDFAVARGI

RTI N GVRG

Análisis con SignalP

Figura III.2.7: Análisis de la región N-terminal de XynB de Paenibacillus barcinonensis en

comparación con la región N-terminal de XynA de Bacillus sp. BP-7 (control +).
En el análisis informático con SignalP, los valores de S score elevados indican secuencias de péptido
señal, los valores de C score superiores a 0,5 indentifican posibles lugares de corte para peptidasas señal,
y el Y score combina en un único estadístico el S score y el C score para una mejor predicción del lugar
de corte de las peptidasas señal.
108

2.4. Estudio de las homologías de 21 (55% de identidad) (Baba et al., 1994),

XynB XynA de Thermobacillus xylanilyticus (54%

de identidad) (Debeche et al., 2000) y XynA
2.4.1. Homologías de XynB de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (52%

La secuencia de aminoácidos de XynB fue de identidad) (Luthi et al., 1990). Estas 6

comparada con secuencias de proteínas xilanasas pertenecen a la familia 10 de glicosil

conocidas contenidas en las bases de datos hidrolasas (familia F de xilanasas).

(NCBI y EMBL).
La máxima homología se encontró con XynX El análisis de potenciales secuencias de

de Aeromonas punctata (85% de identidad) péptido señal en estas 6 proteínas homólogas a

(Usui et al., 1999), XynA2 de Bacillus XynB, usando para ello los programas SignalP

stearothermophilus T-6 (57% de identidad) y PSort, no halló evidencia de que estas

(Shulami et al., 1999), XyaA de Bacillus sp. proteínas presentaran péptidos señal, tal como

N137 (55% de identidad) (Tabernero et al., ya había sucedido con XynB de Paenibacillus

1995), Xyn2 de Bacillus stearothermophilus barcinonensis. Por el contrario, se

680 10 690 20 700 30 710 40 720 50 730 60 740 70

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....
XynA_C.sp. KSLKEKGVPIHGIGLQSHINLDWP-SISEIENTIRLFSSIPGLEIHITELDMS-FYQWGSSTSYSTPPRDLLIK
XynA_D.the KKLKDKGVPIHGIGIQGHWTLAWP-TPKMLEDSIKRFAEL-GVEVQVTEFDISIYYDRNENNNFKVPPEDRLER
XynC_C.sp. KSLKEKGVPIHGIGLQCHINLDWP-SISEIENTIKLFSSIPGLEIHITELDMS-FYQWGSSTSYSTPPRDLLIK
XynE_C.sac KNMKSKGIPIHGVGLQCHINVDSP-SVEEIEETIKLFSTIPGLEIQITELDMS-FYQWGSSVYYVEPSREMLLR
XynA_A.the KSLREKGIPIHGVGLQCHISVSWP-SVEEVEKTIKLFSSIPGIKIHVTEIDISVAKEYGEDIDEET-KRYLLIQ
XynA_C.cel QRLKSKGIPVHGVGHQTHINITWP-SISEIENSLVKFSNL-GVVQEITELDMSIYNNSSQKYDTLP--SDLAQQ
XynB_C.sp. KALHDRGL-IDGVGLQGHINVDSP-AVKEIEDTINLFSTIPGLQIQITELDISVYTSSTQQYDTLP--QDIMIK
XynX_A.pun RSLLDKGAPVHGIGLQGHWNIHGP-SIEEIRMAIERYASL-DVQLHVTELDMSVFRHEDRRTDLTAPTSEMAEL
XynB_BP23 RSLLDQGAPVHGIGMQGHWNIHGP-SMDEIRQAIERYASL-DVQLHVTELDLSVFRHEDQRTDLTEPTAEMAEL
XynA2_B.ste KSLRDKGIPIHGIGMQAHWSLTRP-SLDEIRAAIERYASL-GVVLHITELDVSMFEFHDRRTDLAAPTSEMIER
Xyn2_B.ste KSLRDKGIPIHGIGMQAHWSLNRP-TLDEIRAAIERYASL-GVILHITELDISMFEFDDHRKDLAAPTNEMVER
XynA_T.xyl KWLKEQGAPIHGIGMQGHYNLASP-SIAEVREAIEKYAEL-GLVIHVTELDMSVYAWDDRRTDLLEPTAEMVER
XyaA_B.sp. KSLLDKDVPIHGVGLQAHWNVHDP-SLDDIRAAIERYASL-GIQLQITEMDVSMFSWDNRRADLTQPTEKMLNL
XynA_C.sac KELLERGTPIDGIGIQAHWNIWDKNLVSNLKKAIEVYASL-GLEIHITELDISVFEFEDKRTDLFEPTPEMLEL

Región V Región VI
Región A Región B

Figura III.2.8: Regiones A y B sobre el alineamiento múltiple de las secuencias de proteínas XynA de
Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.1 (XynA_C.sp.) (Gibbs et al., 2000), XynA de Dictyoglomus
thermophilum (XynA_D.the) (Gibbs et al., 1995), XynC de Caldicellulosiruptor sp. (XynC_C.sp.) (Morris
et al., 1999), XynE de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (XynE_C.sac) (PIR T30910), XynA de
Anaerocellum thermophilum (XynA_A.the) (NCBI CAA93627), XynA de Caldibacillus cellulovorans
(XynA_C.cel) (Sunna et al., 2000), XynB de Caldicellulosiruptor sp. (XynB_C.sp.) (Morris et al., 1999),
XynA de Aeromonas punctata (XynX_A.pun), XynB de Paenibacillus barcinonensis (XynB_BP23),
XynA2 de Bacillus stearothermophilus T-6 (XynA2_B.ste), Xyn2 de Bacillus stearothermophilus 21
(Xyn2_B.ste), XynA de Thermobacillus xylanilyticus (XynA_T.xyl), XyaA de Bacillus sp. N137
(XyaA_B.sp.) y XynA de Caldicellulosiruptor saccharolyticus (XynA_C.sac). Se muestrtan también las
regiones V y VI, conservadas en las xilanasas de la familia 10.
 109

identificaron secuencias típicas de péptido homólogas a XynB de Paenibacillus

señal en las otras xilanasas de la familia F barcinonensis ya mencionadas, juntamente
analizadas, todas ellas con un menor nivel de con otras xilanasas de la familia F
homología a XynB de Paenibacillus (Figura III.2.8).
barcinonensis.
Se observó que tanto XynB como las 6
Se realizaron alineamientos múltiples de las xilanasas más homólogas a ella, todas sin
secuencias proteicas de las 6 xilanasas más péptido señal, presentaban 2 regiones

Xyn Cryptococcus albidus

Cex Cellulomonas fimi
XynZ Clostridium thermocellum
XlnA Streptomyces lividans
Xyn Thermoascus aurantiacus
XynA Aspergillus awamori var. kawachii
XynA Pseudomonas fluorescens
XynB Pseudomonas fluorescens
ORF4 Caldocellum saccharolyticum
XynB Butyrivibrio fibrisolvens
XynA Ruminococcus flavefaciens
XynA Butyrivibrio fibrisolvens
XynA Caldibacillus cellulovorans
XynA Bacillus sp. C125
XynB Clostridium stercorarium F-9
XynA Dictyoglomus thermophilum
CelB Caldocellum saccharolyticum
XynE Caldicellulosiruptor saccharolyticus
XynA Caldicellulosiruptor sp. Tok7B.1
XynC Caldicellulosiruptor sp.
XynA Caldicellulosiruptor saccharolyticus
XynX Aeromonas punctata
XynB Paenibacillus barcinonensis BP-23
Xyn Bacillus sp. N137
XynA Thermobacillus xylanilyticus
XynA2 Bacillus stearothermophilus T-6
Xyn2 Bacillus stearothermophilus 21
XynA Anaerocellum thermophilum
XynB Caldicellulosiruptor sp.

Figura III.2.9: Dendrograma de XynB de Paenibacillus barcinonensis con 28 xilanasas de la familia F

(Gilkes et al., 1991; Henrissat y Bairoch 1996). Está señalada la rama a la que pertenecen XynB de
Paenibacillus barcinonensis y las 6 xilanasas más homólogas a esta.
110

altamente conservadas no presentes en el resto

de xilanasas de la familia F. Estas regiones
estaban situadas alrededor de la región VI,
conservada en las xilanasas de la familia F
(Baba et al., 1994; Fukumura et al., 1995); y
se denominaron provisionalmente como región
A, cuya secuencia conservada es AIE_YASL,
y región B, cuya secuencia conservada es
RTDL__PT.

A partir de nuevos alineamientos múltiples

conteniendo más secuencias de xilanasas de la
familia F (Gilkes et al., 1991; Henrissat y
Bairoch 1996) se obtuvo el árbol filogenético
para estas xilanasas que se muestra en la
Figura III.2.9.

En este árbol, XynB de Paenibacillus

barcinonensis junto con las 6 xilanasas
homólogas que no contienen péptido señal
quedaron segregadas, formando un cluster o
agrupamiento separado del resto de xilanasas
de la familia 10.
CAPÍTULO IV.
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS CON LA XILANASA
XYNB DE PAENIBACILLUS BARCINONENSIS
 113

1. - INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 2. - RESULTADOS

Las peculiares características de la xilanasa B
(XynB) de Paenibacillus barcinonensis la 2.1. Análisis estructural y
convierten en una enzima de interés tanto funcional de XynB de
desde el punto de vista básico como aplicado. Paenibacillus barcinonensis

Para profundizar en el conocimiento de esta 2.1.1 Análisis de la estructura primaria

enzima así como para mejorar sus cualidades Para averiguar los posibles dominios
para una posible aplicación en la industria, se funcionales y estructurales de XynB, se usaron
decidió realizar estudios de estructura-función los servicios on-line Pfam y ProDom, que se
y experimentos de ingeniería de proteínas. basan en la búsqueda de homologías de
En base a esto, los objetivos de este capítulo secuencia con dominios de proteínas ya
fueron: conocidas.
- El análisis estructural de la xilanasa B de
Paenibacillus barcinonensis. La búsqueda en Pfam dio como resultado la

- Estudio de la relación estructura-función en identificación, entre los aminoácidos 44 y 244

la xilanasa B mediante mutagénesis de XynB, de una región altamente homóloga a

dirigida. un dominio típico de glicosil hidrolasas de la

familia 10 (número de acceso PF0033). Este
- La purificación y la cristalización de la
dominio, anteriormente denominado
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis.
glycosyl_hydro3 y cuya denominación actual
- Ensayos de mutagénesis aleatoria (PCR
en Pfam es Glyco_hydro_10, engloba el centro
mutagénica y shuffling) para aumentar la
activo de esta familia de enzimas, así como el
termoestabilidad de la xilanasa B.
núcleo de la estructura en forma de
- Estudio de la relación estructura-función en
TIM-barrel o barril (α/β)8 de dichas enzimas.
la xilanasa B a partir del análisis de las
Las diferentes familias de glicosil hidrolasas
enzimas mutantes obtenidas.
con este plegamiento terciario se agrupan
dentro de un clan o superfamilia, denominado
Tim barrel glycosyl hydrolase superfamily
(denominación en Pfam) o clan GH-A. Las
familias de este clan presentarían un origen
evolutivo común.
114
Por su parte, los resultados obtenidos de la
búsqueda en ProDom (Figura IV.2.1)
indicaban que la proteína XynB contenía
regiones homólogas a 3 dominios presentes en
su base de datos (versión 2001.3):
– Al dominio 809, hacia la región N-terminal
y central de XynB. Este dominio es típico
de glicosil hidrolasas de la familia 10 y
engloba las regiones conservadas I a VI de
dicha familia (Baba et al., 1994; Fukumura
et al., 1995).
– Al dominio 5864, hacia la
C-terminal de XynB. Este
también es típico de glicosil hidrolasas de
la familia 10 y engloba las regiones
conservadas VII a VIII típicas de esta
familia (Fukumura et al., 1995).
– A un dominio localizado entre los 2
dominios anteriores, que recibía el número
de identificación 277407 y que solamente
se encontraba presente en XynB y las otras
6 xilanasas sin péptido señal homólogas a
ella, mencionadas en el capítulo anterior.
Prodom Release 2001.3
0 100 200 300
809 277407 5864
Figura IV.2.1: Predicción de dominios para la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis según
ProDom (2001.3).
El hecho de que tanto en XynB
Paenibacillus barcinonensis como en las otras
6 xilanasas homólogas a ella y sin péptido
señal, aparecía un dominio no presente en
otras xilanasas y que contenía además la
región B (RTDL__PT) identificada
previamente en este grupo de xilanasas
(Figura III.2.8 del capítulo III) confería un
interés adicional al estudio de XynB.
Actualmente, según la versión 2005.1 de la
base de datos de ProDom, la enzima XynB
presenta regiones homologas a 5 dominios,
dos de los cuales, PD000809 y PD005864,
corresponden a los anteriores 809 y 5864, y los
otros tres, situados a N-terminal, son dominios
región típicos de glicosil hidrolasas de la familia 10;
dominio desapareciendo cualquier referencia al antiguo
dominio 277407.
2.1.2. Predicción de estructura
secundaria y terciaria
Se realizó un análisis informático de la
estructura secundaria de la proteína utilizando
para ello los servicios on-line Jpred y
SCRATCH. Ambos servicios usan programas
de predicción 2D basados en alineamientos
múltiples (generados con PSI-BLAST) de la
secuencia introducida y en el posterior
400 procesamiento de estos alineamientos
mediante redes neuronales.
XynB
Los resultados obtenidos sugerían que XynB
presentaba 8 regiones de hélice α y 8 regiones
de conformación β, intercaladas por varias
regiones no estructuradas (Figura IV.2.2).
de
Tal como hemos indicado anteriormente, en
las enzimas de la familia 10 de glicosil
hidrolasas estas estructuras secundarias
 115

1---------11--------21--------31--------41--------51--------61--------71--------81--------91-------100
XynB : MSTEIPSLSASYANSFKIGAAVHTRMLQTEGEFIAKHYNSVTAENQMKFEEVHPREHEYTFEAADEIVDFAVARGIGVRGHTLVWHNQTPAWMFEDASGGTA
jalign : -----HHHHHHH-------EE--------HHHHHHH---------------------------HHHHHHHHHH---EE--EEEEEE------EEE-------
jfreq : --HHHHHHHHHH--------EE-HHHHHHHHHHHHHH-------------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEEE-----EEEE-------
jhmm : ---HHHHHHHHH-----EEEEE-------HHHHHHHH---EE------------------HH-HHHHHHHHHH----EE-EEEE------------------
jnet : --HHHHHHHHHH-----EEEEE---HHHHHHHHHHHH---EEE-------------------HHHHHHHHHHH---EEEEEEEEEE-----EEEE-------
jpssm : -----HHHHHHH-----EEEE------H--HHHHHH----EEE-------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEE------EEEE-------
jpred : ---HHHHHHHHH-----EEEEE-------HHHHHHHH---EE--------------------HHHHHHHHHHH---EEE-EEEEEE-----EEEE-------

101-----111-------121-------131-------141-------151-------161-------171-------181-------191--------202
XynB : SREMMLSRLKQHIDTVVGRYKDQIYAWDVVNEAIEDKTDLIMRDTKWLRLLGEDYLVQAFNMAHEADPNALLFYNDYNETDPVKREKIYNLVRSLLDQGAPV
jalign : HHHHHHHHHHH-HHHHEEE----EEEEEEEEEE------------EEEE----HHHHHHHHHHHH-----EEEE---------HHHHHHHHHHHHH------
jfreq : -HHHHHHHHHH-EEEEEEE---EEEEEEEE-EEE-----------EEE-----HHHHHHHHHHHH-----HHHH---------HHHHHHHHHHHHHH-----
jhmm : -HHHHHHHHHHHHHHHHHH----EEEEEEEEEE-------------HHE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH-----
jnet : -HHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEE-------------EE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH-----
jpssm : -HHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEEE-------------E----HHHHHHHHHHHHHH----EEEEE--------HHHHHHHHHHHHH------
jpred : -HHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEEEEE-------------EE---HHHHHHHHHHHHHH----EEEE---------HHHHHHHHHHHHHH-----

203---211-------221-------231-------241-------251-------261-------271-------281-------291----------304
XynB : HGIGMQGHWNIHGPSMDEIRQAIERYASLDVQLHVTELDLSVFRHEDQRTDLTEPTAEMAELQQKRYEDIFGLFREYRSNITSVTFWGVADNYTWLDNFPVR
jalign : ---------------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEE------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
jfreq : -----EEE--------HHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
jhmm : --EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEE------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
jnet : --EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
jpssm : --EEEE----------HHHHHHHHHHHH----EEEEEEE-----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------
jpred : --EEEEEE-------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE-----------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEEEEE-------------

jalign - Predicción de Jnet según el alineamiento múltiple

305-311-------321------330
XynB : GRKNWPFVFDTELQPKDSFWRIIGQD
jfreq - Predicción de Jnet según la frecuencia de perfiles de PSI-BLAST
jalign : --------------------EE---- jhmm - Predicción de Jnet basada en “hidden Markov models” (HMM)
jfreq : ------------------EEEE---- jnet - Predicción de Jnet con parámetros estándar
jhmm : ----------------HHHHHH---- jpssm - Predicción de Jnet según la “position-specific scoring matrix” (PSSM)
jnet : -----------------HHHHH----
jpssm : ------------------HH------
de PSI-BLAST
jpred : ------------------HHHH---- jpred - Predicción consenso

Figura IV.2.2: Predicción de la estructura secundaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis usando el

servicio Jpred. Las H en rojo indican la predicción de regiones de hélice α y las E en naranja indican la
predicción de regiones de hebras β. En azul se indican los glutámicos catalíticos, y en violeta la región B.

conforman un plegamiento tridimensional Para comprobar esta hipotética estructura

conocido como TIM-barrel o barril (α/β)8. secundaria, y continuar con el estudio de
XynB, se obtuvo un modelo por homología de

A C

Figura IV.2.3: Imágenes del modelo de la estructura terciaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis,
generado por el servicio SWISS-MODEL. Las hélices α están coloreadas en rojo, las hebras β en amarillo y
los bucles o loops en verde claro. Los 2 aminoácidos catalíticos están coloreados en azul. Puede observarse
tanto la representación de lazos (A y B), como de la superficie (C).
116

la estructura terciaria de la enzima, usando visto, formaría parte del dominio 277407
para ello el servicio SWISS-MODEL según ProDom versión 2001.3.
(Figura IV.2.3).
Tal como se puede observar en el modelo, la Se realizaron 3 delecciones distintas
estructura de la xilanasa B sería la típica de (Figura IV.2.4):
barril (α/β)8 con elementos adicionales de – Una delección que englobaba sólo los
estructura secundaria (Figura IV.2.3.A). Los aminoácidos 253 a 256 de XynB
aminoácidos catalíticos de esta enzima (Δ253-256), y que correspondía a la
quedarían muy próximos hacia el interior del secuencia RTDL de la región B.
barril en una hendidura de la superficie de la – Una segunda delección más amplia
proteína (Figura IV.2.3.C). La región B correspondiente a los aminoácidos 253 a
(RTDL__PT), previamente identificada en el 260 (Δ253-260), y que incluía toda la
grupo de xilanasas sin péptido señal, aparecía región B de XynB.
localizada en uno de los bucles (loops) – La delección de todo el dominio 277407,
exteriores de la estructura terciaria de la comprendiendo los aminoácidos 249 a 261
proteína. (Δ249-261).

Estas delecciones se introdujeron en el gen

2.1.3. Mutagénesis dirigida
xynB contenido en el plásmido pX60
Para estudiar la posible funcionalidad de la (pUC19-X20) mediante amplificación por
región B presente en XynB, se decidió obtener PCR divergente en un sólo paso con la pareja
proteínas mutantes derivadas de XynB en las de cebadores adecuada (Figura IV.2.4) y
que dicha región estuviera deleccionada total o posterior religación de los amplificados.
parcialmente. La región B, como ya hemos

240 250 260 270 Cebador Secuencia Delección

277407 Δ253-256
XynB TELDLSVFRHEDQRTDLTEPTAEMAELQQKR BKDEL_AB CTGATCCTCGTGACGAAAC
XynB Δ253-256 TELDLSVFRHEDQ----TEPTAEMAELQQKR Δ253-260
XynB Δ253-260 TELDLSVFRHEDQ--------AEMAELQQKR
TELDLSVFR-------------EMAELQQKR FWDEL_A ACCGAGCCAACGGCAGAG Δ253-256
XynB Δ249-261
FWDEL_B GCAGAGATGGCAGAGCTG Δ253-260
240 250 260 270
BKDEL_C ACGAAACACAGACAGATCC Δ249-261
FWDEL_A
BKDEL_AB FWDEL_C GAGATGGCAGAGCTGCAGC Δ249-261
FWDEL_B

BKDEL_C FWDEL_C

Figura IV.2.4: Delecciones de XynB y cebadores diseñados para la amplificación de xynB sin los
fragmentos a deleccionar.
 117

Los plásmidos obtenidos fueron clonados en 2.2.1. Obtención de clones

E. coli DH5α, se seleccionaron los clones
recombinantes, y se comprobó
secuenciación la correcta introducción de las
delecciones en el gen xynB.
Para analizar la actividad de las xilanasas
deleccionadas construidas, se obtuvieron
extractos celulares de los
recombinantes correspondientes y se ensayó su
actividad enzimática sobre xilano de madera
de abedul y pNPX, a temperatura ambiente y
pH 5,5 y 7.
En ninguno de los ensayos se obtuvieron
valores detectables de actividad, hecho que
indicaba que estas xilanasas deleccionadas
construidas no eran funcionales.
2.2. Purificación y cristalización
de XynB
Para aumentar los conocimientos estructurales
sobre XynB se decidió llevar a cabo la
resolución de su estructura terciaria mediante
cristalografía y difracción de rayos X.
sobreproductores de XynB
por Con el fin de obtener elevada cantidad de
XynB, que facilitara su purificación y
posterior cristalización, se decidió su
clonación en vectores de expresión bajo el
control de un promotor inducible.
Se eligió para ello el sistema pET, en concreto
clones el plásmido pET3b, que permite clonar genes
bajo el control del promotor fuerte e inducible
del fago T7.
Para ello, se amplificó el gen xynB a partir de
ADN plasmídico de pX60 mediante cebadores
que contenían las dianas NdeI y BamHI,
necesarias para clonar el gen en la dirección
adecuada (Figura IV.2.5).
A continuación el fragmento amplificado se
clonó en el vector pET3b, entre las dianas de
restricción para las mencionadas enzimas,
obteniéndose así el plásmido pET3b-X20
(Figura IV.2.6).
Este plásmido se transformó en la cepa E. coli
BL21(DE3), que al contener el lisógeno λDE3
en su cromosoma es capaz de expresar la ARN
polimerasa de T7 al añadir IPTG al medio de
cultivo.

Cebador Secuencia Región de hibridación

FWX20pET1 NdeI Cadena + después del RBS de
ACCCATATGTCTACCGAAATTCCG xynB.
BamHI Cadena - después de la pauta
BKX20pET1 CTTATAGGATCCTAGTCTTGCCCG abierta de lectura de xynB.

Figura IV.2.5: Cebadores diseñados para la amplificación de xynB y posterior clonación en

pET3b.
118

A pesar de estos problemas, el clon E. coli

T7Ter BamHI BL21(DE3)/pET3b-X20 2b fue utilizado con
éxito para la purificación de la xilanasa B
xynB
mediante cromatografía de alta resolución
(1 kb)
Amp R (FPLC). Dicha purificación fue realizada por
pET3b-X20 NdeI el grupo de Estructura y Función de Enzimas
T7Pro del Dr. Julio Polaina, del Departamento de
5,6 kb
Biotecnología de los Alimentos, en el Instituto
de Agroquímica y Tecnología de Alimentos
(IATA-CSIC, Valencia).
ORI

La proteína purificada fue cristalizada a

Figura IV.2.6: Plásmido pET3b-X20, resultante continuación por Pablo Isorna del grupo de
de clonar el gen xynB en pET3b.
Cristalografía Macromolecular y Biología
Los clones recombinantes obtenidos se Estructural de la Dra. Julia Sanz-Aparicio, en
seleccionaron por su actividad enzimática en el Instituto de Química-Física Rocasolano
placas de agar LB suplementado con (CSIC, Madrid).
xilano-RBB e IPTG.
Tabla IV.2.1: Actividad sobre pNPX de los clones
recombinantes con pET3b-X20 seleccionados.
Al ensayar la actividad sobre pNPX de
extractos de cultivos inducidos con IPTG de Actividad % Actividad
sobre pNPX respecto al
los diferentes clones seleccionados, todos ellos
(U/mg de clon con
conteniendo el plásmido pET3b-X20, se Clones proteína) pX60
observaron importantes diferencias entre ellos, E. coli
BL21(DE3)/ 0,504 4367,8
aunque en todos los casos la actividad fue pET3b-X20 2b
superior a la del clon original E. coli 5K/pX60 E. coli
(Tabla IV.2.1). BL21(DE3)/ 0,078 679,6
pET3b-X20 3b
Asimismo, se observó una reducción de la E. coli
actividad a lo largo de diferentes resiembras de BL21(DE3)/ 0,026 225,6
pET3b-X20 5b
los clones, lo que, juntamente con los
E. coli 5K/
resultados anteriores, parece indicar problemas 0,012 100,0
pX60
de estabilidad de la construcción pET3b-X20 E. coli
en la cepa E. coli BL21(DE3). BL21(DE3)/ 0,000 0,0
pET3b (C -)
 119

B C
Figura IV.2.7: Imágenes de la estructura terciaria de XynB de Paenibacillus barcinonensis, obtenidas a
partir del análisis de difracción de rayos X de sus cristales (esquina superior izquierda). Las hélices α están
coloreadas en rojo, las hebras β en amarillo y los bucles en verde. Los 2 aminoácidos catalíticos están
coloreados en azul. Puede observarse tanto la representación de lazos (A y B), como la de superficie (C).

2.2.2. Resultados de cristalografía máximas diferencias se observan en el bucle

Tras la obtención de cristales de la proteína L7 (Figura IV.2.8), que une la lámina β7 con
XynB, se recogió el espectro de difracción de la hélice α7 del barril (aminoácidos S245-
rayos X y se resolvió la estructura T260). Este bucle es esencial en la
tridimensional de la enzima a una resolución
de 2 Å (Figura IV.2.7).
Esta estructura tridimensional resultó ser la
típica de xilanasas de la familia 10, el barril
(α/β)8, tal como se había observado
previamente en el modelo teórico obtenido por
homología (Figura IV.2.3). Las principales
diferencias entre dicho modelo teórico y la
estructura real de XynB se encontraban en los
bucles que conectan los extremos N-terminal
de las láminas β con las hélices α
(Figura IV.2.8), cosa coherente con el hecho Figura IV.2.8: Comparación entre la estructura
de que estas regiones son las más difíciles de tridimensional de XynB obtenida mediante
modelado por homología (en azul) y la obtenida a
modelar por homología, ya que son las que partir de los análisis de difracción de rayos X (en
amarillo). El bucle L7, que une β7 con α7 del
presentan mayor variabilidad secuencial. Las barril, está representado en negro en la estructura
experimental.
120

conformación del centro activo, siendo el
máximo responsable de la forma
especificidad del centro activo en los subsitios
de la parte positiva.
Según la estructura tridimensional obtenida,
los dos aminoácidos catalíticos de la enzima
quedarían muy próximos entre ellos hacia el
interior del barril (α/β)8 (Figura IV.2.7.B) en
una hendidura de la superficie de la enzima
(Figura IV.2.7.C).
Al observar con más detalle este surco o
hendidura catalítica, se distinguen claramente
los subsitios -2, -1, +1 y +2 de unión a las
xilosas del sustrato, aunque también es
probable la existencia de los subsitios -3, +3 y
+4 (Figura IV.2.9).
Destaca la presencia a nivel del subsitio -1 de
los 2 residuos de ácido glutámico implicados
en la hidrólisis del sustrato (E241 y E134), así
y como la de otros residuos aromáticos (W299,
Y179 y F303) que ayudarían a posicionar
correctamente los anillos de xilosa del sustrato
en los diferentes subsitios para permitir la
hidrólisis del enlace glicosídico.
También es importante señalar la presencia de
una cavidad a nivel del subsitio +2, que
permitiría acomodar sustituyentes laterales en
la cadena de xilosas del sustrato (como por
ejemplo metil glucurónico).
Esta cavidad viene determinada
estructuralmente por el bucle L7, que contiene
la secuencia consenso RTDL__PT presente en
el grupo de xilanasas sin péptido señal
homólogas a XynB. Los residuos R248, H249
y E250 de este bucle son además los
principales responsables de la especificidad de
los subsitios +2 y +3.

Figura IV.2.9: Surco catalítico de XynB de Paenibacillus

A barcinonensis, en el que se ha modelado una cadena de xilosas,
hidrolizada a nivel del subsitio -1, y un posible anillo de
metil glucurónico en el O2 de la xilosa del subsitio +2. También se
han representado los residuos R248, H249 y E250 del bucle L7,
altamente variables y máximos responsables de la especificidad de
los subsitios +2 y +3 (A).
Ampliación de los subsitios -2, -1 y +1, y aminoácidos implicados
en el posicionamiento de las xilosas del sustrato para que los
residuos catalíticos E241 y E134 del subsitio -1 puedan llevar a
cabo la hidrólisis (abajo).

Subsitio -2 Subsitio -1 Subsitio +1

 121

mutagénica que permitió obtener diferentes

2.3. Aumento de la variantes mutantes de dicho gen.
termorresistencia de XynB de
Paenibacillus barcinonensis A continuación, se mezclaron los diferentes

Con el fin de mejorar las características de la amplificados mutagenizados y se sometieron a

enzima XynB para facilitar su utilización en un proceso de DNA shuffling (recombinación

procesos biotecnológicos, y asimismo in vitro por PCR).

aumentar el conocimiento sobre la relación Este proceso consiste en fragmentar las

entre estructura y función de esta xilanasa, nos diferentes copias mutagenizadas de forma

planteamos aumentar su termorresistencia. aleatoria con DNAsa I y después volver a

recomponer el gen mediante una primera PCR
sin cebadores (PCR I), que permite la mezcla
2.3.1 Mutagénesis aleatoria aleatoria pero ordenada de los diferentes
Dados los problemas para obtener resultados fragmentos (con o sin mutaciones), y una
mediante mutagénesis dirigida, descritos en el segunda PCR (PCR II) utilizando los mismos
apartado 2.1.3 y los pocos conocimientos que cebadores utilizados en la PCR mutagénica
disponíamos sobre la relación estructura- inicial, que permite obtener la gran variedad de
función para XynB, se decidió recurrir a la copias mutantes del gen generadas durante el
mutagénesis aleatoria para generar una gran proceso.
variabilidad de copias mutantes del gen xynB
entre las que poder seleccionar después El ADN amplificado resultante se ligó al
aquellas que diesen lugar a enzimas con una vector pGEM-T (Promega), consistente en el
mayor termoestabilidad (estrategia conocida plásmido pGEM digerido con EcoRV
como evolución dirigida) (Kaur y Sharma, (extremos romos) al que se ha añadido una
2006). timina (T) en cada extremo 3' libre para
aumentar la eficacia de clonación de
Primeramente, a partir del plásmido pX60 y fragmentos de ADN provenientes de
utilizando los cebadores CL1 y CL3 amplificación con polimerasas que añaden una
(Figura IV.2.10), se realizó una PCR adenina en 3', como es el caso de la Taq
polimerasa que se utilizó en estos
Cebador Secuencia
experimentos.
CL1 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
El resultado de ligación se transformó en
CL3 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC E. coli DH5α, y de entre los transformantes
Figura IV.2.10: Cebadores que flanquean el obtenidos se seleccionaron aquellos que
polylinker de pUC19, utilizados en la PCR para
expresaban una xilanasa funcional (aquellos
amplificar xynB y en la PCR II del DNA shuffling.
122
donde las mutaciones introducidas durante el
proceso mutagénico no habían inactivado la
enzima).
Para ello se hicieron réplicas de las placas que
contenían los transformantes y, tras el
crecimiento de las colonias y la lisis mediante
cloroformo, se les aplicó una sobrecapa
(overlay) de agarosa sólida que contenía
pNPX, seleccionándose aquellas colonias que
daban lugar a un halo amarillo al cabo de
pocos minutos, hecho que implicaba la
degradación del pNPX por la xilanasa
expresada. La actividad sobre pNPX de los
clones positivos era reevaluada nuevamente
mediante la técnica del overlay, comparando
con un control + (E. coli DH5α/pX60) y un
control – (E. coli DH5α).
Al final del proceso, se obtuvieron muy pocos
clones que expresaran una xilanasa funcional,
lo que obligó a realizar múltiples ciclos de
shuffling y selección a partir de los
amplificados de la PCR mutagénica.
De esta manera se obtuvieron un total de 35
clones que contenían una xilanasa B funcional,
y posiblemente mutada.
Para aumentar la cantidad de mutantes activos,
se repitió el proceso mutagénico, pero esta vez
se optó por sustituir la PCR mutagénica inicial
por una PCR de amplificación estándar
utilizando una polimerasa Taq, hecho que
reducía la tasa de mutación en este paso a la
tasa de error típica de la polimerasa Taq
(2x10-5 mutaciones por nucleótido y ciclo). A
continuación se realizó el proceso de
shuffling, clonación, transformación y
selección tal como se ha descrito previamente.
De esta manera, tras 3 ciclos de shuffling y
selección, se obtuvieron un total de 48 nuevos
clones que contenían una xilanasa B funcional
potencialmente mutada.
Entre las dos aproximaciones de mutagénesis
aleatoria utilizadas se obtuvo un total de 83
posibles mutantes para xynB. Los clones
provenientes de la primera aproximación
mutagénica fueron numerados del 1 al 35, y
del 36 al 83 los clones provenientes de la
segunda aproximación.
2.3.2 Selección de mutantes
termorresistentes
Para seleccionar aquellos clones que poseían
variantes mutagenizadas del gen xynB que
dieran lugar a una xilanasa más
termorresistente que la salvaje, se realizó en
primer lugar un escrutinio cualitativo.
En este primer paso de selección, varias
réplicas de las placas que contenían los 83
clones obtenidos fueron sometidas a choques
térmicos de 45, 50, 60, 70 y 80 ºC, durante 15
y 30 min.
Tras cada choque térmico, utilizando la técnica
del overlay con pNPX se comparaba la
intensidad de color amarillo que se apreciaba
para cada clon (relacionada con el grado de
actividad residual de la xilanasa expresada)
 123

Tabla IV.2.2: Intensidad relativa de coloración amarilla de los clones obtenidos por mutagénesis aleatoria,
tras choque térmico a diferentes temperaturas y revelado de la actividad usando overlays con pNPX.
45 ºC 50 ºC 60 ºC 70 ºC 80 ºC 45 ºC 50 ºC 60 ºC 70 ºC 80 ºC
Clon 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' Media Clon 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' 15' 30' Media
C+ 100 100 100 100 100 13 13 0 0 0 53 36 100 50 0 50 0 0 0 0 0 22
1 100 100 0 50 0 0 0 0 0 28 37 100 50 0 25 0 0 0 0 0 19
2 100 100 0 50 0 0 0 0 0 28 38 100 100 100 150 0 0 0 0 0 50
3 200 200 200 200 100 50 0 0 0 106 39 100 100 100 150 0 0 0 0 0 50
4 200 100 100 50 0 0 0 0 0 50 40 50 100 100 50 0 0 0 0 0 33
5 100 100 50 75 0 0 0 0 0 36 41 100 100 100 100 50 0 25 0 0 0 48
6 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39 42 100 200 100 100 150 0 25 0 0 0 68
7 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56 43 100 100 100 100 75 0 25 0 0 0 50
8 100 100 100 75 25 25 0 0 0 47 44 100 0 100 100 75 0 25 0 0 0 40
9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45 50 100 50 100 100 0 0 0 0 0 40
10 100 200 200 50 100 25 0 0 0 75 46 100 100 100 0 25 0 25 0 0 0 35
11 100 100 100 75 100 0 0 0 0 53 47 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
12 100 100 0 25 0 0 0 0 0 25 48 100 100 100 100 50 0 25 0 0 0 48
13 100 100 200 100 50 50 0 0 0 67 49 100 100 100 100 75 0 25 0 0 0 50
14 0 0 0 0 0 0 50 100 100 100 100 150 0 25 0 0 0 58
15 100 200 200 100 50 0 0 0 0 72 51 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
16 100 100 100 100 0 50 0 0 0 50 52 100 100 100 100 150 0 25 0 0 0 58
17 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39 53 100 100 100 200 100 0 50 0 25 0 68
18 100 100 100 75 25 0 0 0 0 44 54 100 100 100 100 150 0 0 0 0 0 55
19 100 100 100 50 0 0 0 0 0 39 55 100 100 100 100 100 0 50 0 50 0 60
20 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56 56 100 100 100 100 100 25 100 0 50 0 68
21 100 100 100 100 50 50 0 0 0 56 57 100 50 100 50 50 0 25 0 0 0 38
22 50 100 100 125 0 0 0 0 0 42 58 50 100 50 100 50 0 0 0 0 0 35
23 100 100 0 0 0 0 0 0 0 22 59 100 200 100 200 75 0 100 0 25 0 80
24 75 0 0 0 0 0 13 60 200 100 200 100 125 0 25 0 0 0 75
25 100 100 0 100 0 0 0 0 0 33 61 100 100 100 200 150 0 50 0 25 0 73
26 100 100 50 100 0 0 0 0 0 39 62 100 100 100 100 100 25 50 0 50 0 63
27 100 100 0 150 0 0 0 0 0 39 63 100 100 100 100 100 100 100 0 50 0 75
28 100 100 100 100 50 25 0 0 0 53 64 100 100 100 100 150 100 100 0 50 0 80
29 100 100 100 100 50 25 0 0 0 53 65 100 50 100 50 100 0 0 0 0 0 40
30 200 200 100 150 0 0 0 0 0 72 66 100 50 100 50 50 0 0 0 0 0 35
31 100 50 0 0 0 0 0 0 0 17 67 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
32 100 100 100 75 0 0 0 0 0 42 68 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 5
33 100 100 50 75 25 0 0 0 0 39 69 100 100 100 100 100 0 50 0 50 0 60
34 50 50 100 125 0 0 0 0 0 36 70 100 0 100 0 0 0 0 0 0 0 20
35 100 100 100 200 50 0 0 0 0 61 71 100 100 100 100 100 0 50 0 0 0 55
72 100 100 100 50 75 0 0 0 0 0 43
73 200 100 200 200 150 0 50 0 0 0 90
74 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
75 100 100 100 100 100 0 25 0 0 0 53
76 100 0 25 0 0 0 21
77 100 200 100 100 100 0 50 0 50 0 70
78 100 100 100 50 150 0 25 0 0 0 53
79 100 200 100 50 75 0 25 0 0 0 55
80 100 100 100 100 150 50 50 0 50 0 70
81 100 100 100 50 75 0 0 0 0 0 43
82 100 100 100 0 100 0 0 0 0 0 40
83 100 100 100 0 100 0 0 0 0 0 40
124

con la intensidad que se apreciaba en un incluyó una PCR mutagénica inicial

control + (E. coli DH5α/pX60) que no había
sido sometido a ningún choque térmico.
En función de la relación de intensidades de
coloración amarilla de cada clon, a cada
temperatura y a los 2 tiempos de incubación
ensayados (Tabla IV.2.2), se seleccionaron los
siguientes clones para proseguir con su
estudio:
– Por elevada termorresistencia: clones 53,
55, 56, 59, 61, 62, 63, 64, 69, 77 y 80.
– Por elevada actividad y termorresistencia:
clones 3, 60 y 73.
– Por elevada actividad y moderada
termorresistencia: clon 30.
– Por elevada actividad, aunque
termorresistencia: clones 4 y 15.
Tal como se puede observar, la mayoría de los
clones preseleccionados (13 de 17) provenían
del proceso de mutagénesis en el que no se
(Tabla IV.2.2).
Una vez realizado el escrutinio cualitativo, se
procedió a verificar de manera cuantitativa la
termorresistencia de los clones seleccionados,
mediante ensayos de la actividad residual
sobre pNPX de los extractos celulares crudos
de estos clones y de un control + (E. coli
DH5α/pX60), tras preincubaciones de dichos
extractos a 45 ºC durante 0, 10, 20 y 30 min.
Las gráficas obtenidas al representar el
logaritmo neperiano del porcentaje de
actividad residual en relación al tiempo de
preincubación (Figura IV.2.11) permitieron
baja calcular las pendientes de las rectas de
inactivación o termorresistencia, las cuales se
utilizaron para seleccionar los clones mutantes
que presentaban una variante de la xilanasa B
más termoestable que la xilanasa salvaje
(control +).

Control + Mutante 80

100 5,00
Ln(%Actividad máxima)

y = -0,0552x + 4,4345
%Actividad máxima

80 4,00

60 3,00
y = -0,0852x + 4,4968
40 2,00

20 1,00

0 0,00
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo de incubación a 45ºC (min) Tiempo de incubación a 45ºC (min)

Figura IV.2.11: Ejemplo de la comparación entre la termoestabilidad de la xilanasa B de extractos crudos

de uno de los mutantes seleccionados (el 80) respecto a la del control +. Se muestran las rectas de regresión
obtenidas en cada gráfica para calcular la pendiente.
 125

En estas gráficas, cuanto más cercano a 0 es el – Por su elevada termorresistencia: clones

valor de la pendiente mayor es la 55, 62, 63 y 64.
termoestabilidad de la enzima (Tabla IV.2.3). – Por su elevada termorresistencia y
actividad específica: clon 80.
Para comprobar también la elevada actividad
aparente de algunos de los clones
2.3.3 Secuenciación de los mutantes
seleccionados, se determinó la actividad
seleccionados y aislamiento de las
específica sobre pNPX de los extractos
mutaciones
celulares crudos de todos ellos (Tabla IV.2.3).
Con el fin de localizar aquellas mutaciones
Tabla IV.2.3: Pendientes de las rectas de que producían cambios en la secuencia
termorresistencia y actividad específica sobre aminoacídica de XynB que pudieran ser
pNPX de los clones seleccionados.
responsables del aumento de la
Actividad específica termoestabilidad o de la actividad específica
Clones Pendiente (U/mg)
de la enzima, se secuenció el gen xynB
3 -0,12 0,08
4 - - contenido en los plásmidos recombinantes de
15 -0,07 0,13 los diferentes clones mutantes.
30 -0,08 0,34
53 -0,09 0,64
55 -0,06 0,03 Para ello se diseñó una serie de 5 nuevos
56 -0,09 0,15
59 -0,10 0,27 cebadores solapantes que permitieran cubrir
60 -0,15 0,02 toda la pauta abierta de lectura de xynB así
61 -0,08 0,86
como la parte de la región 5' no codificante
62 -0,04 0,09
63 -0,04 0,05 (upstream) clonada en los plásmidos
64 -0,06 0,10 (Figura IV.2.12).
69 -0,11 0,02
73 -0,10 1,73
77 -0,08 0,04 Cebador Secuencia
80 -0,06 1,38 CL3 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
Control + -0,09 0,13
OG376 (FWXB1) CACACTCTGGTATGGC
OG377 (FWXB2) CACGGTCCTTCTATGG
OG378 (BKXB1) TCAAGGGCTGCATGC
En base a los resultados obtenidos respecto al OG379 (BKXB2) CATGAAGCTGTACATCC
OG380 (BKXB3) TCTCTCTGGAAGCCG
control +, se seleccionaron los siguientes 9
CL3 OG376 (FWXB1) OG377 (FWXB2)
clones mutantes:
xynB ORF

– Por su elevada actividad específica: clones 1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

OG380 (BKXB3) OG379 (BKXB2) OG378 (BKXB1)

30, 53, 61 y 73.
Figura IV.2.12: Cebadores utilizados en la
secuenciación de xynB y sus variantes mutantes.
126

Una vez obtenidas las secuencias completas de
los genes xynB de los mutantes 30, 55, 61, 62,
63, 64 y 80 (los correspondientes a los
mutantes 53 y 73 no se pudieron secuenciar),
éstas fueron comparadas con la secuencia del
gen xynB salvaje en busca de mutaciones en la
región codificante del gen. Los resultados se
resumen en la Tabla IV.2.4.
Tabla IV.2.4: Mutaciones en la secuencia de xynB
de los clones mutantes seleccionados.
mutante 80, termoestable y de elevada
actividad.
El siguiente paso fue el aislamiento de estas
mutaciones de otras posibles mutaciones
presentes en regiones reguladoras o en el
vector de los mutantes obtenidos, para poder
así estudiar el efecto independiente de cada
una de ellas sobre la termoestabilidad de la
xilanasa B.

Cambio Cambio Primero, a partir del plásmido pX60 se

Mutante nucleotídico aminoacídico
30 2 mutaciones no codificantes amplificó el gen xynB salvaje usando los
A411T E137D cebadores CL1 y CL3 (Figura IV.2.10) y la
C618T G206
polimerasa Pfu, para evitar introducir nuevas
C681A I227
C909T F303 mutaciones.
G967A D323N
A continuación, el resultado de amplificación
53 -
55 T592C L198 fue purificado y adenilado en sus extremos 3'
61 1 mutación no codificante para simular una amplificación con Taq
62 T36C Y12
63 2 mutaciones no codificantes polimerasa y así poder clonarlo en el plásmido
C44T S15L pGEM-T easy (pGEM-Te), obteniéndose, tras
64 2 mutaciones no codificantes
C44T S15L su transformación en E. coli, la cepa
73 - recombinante E. coli DH5α/pGEM-Te-X20.
80 A277G M93V
Esta cepa fue verificada en cuanto a su
actividad, mediante ensayos enzimáticos, y el
Tal como se puede observar, el conjunto de
gen xynB fue secuenciado, para asegurar que
mutantes secuenciados contenía únicamente 4
no existía ninguna diferencia respecto a la
mutaciones que producían sustituciones
xilanasa B original.
aminoacídicas, que fueron seleccionadas para
su estudio: E137D y D323N presentes en el
Las 4 mutaciones seleccionadas fueron
mutante 30, de elevada actividad; S15L
introducidas en el plásmido pGEM-Te-X20
presente en los mutantes termoestables 63 y 64
mediante mutagénesis dirigida, utilizando la
(que resultaron ser idénticos a nivel de
técnica de amplificación por PCR divergente
secuencia de xynB); y M93V presente en el
en un solo paso y 4 parejas de cebadores que
 127

permitían la introducción de las mutaciones pGEM-Te-X20S15L y pGEM-Te-X20M93V)

(Figura IV.2.13). fueron transformados en E. coli DH5α,
obteniéndose así 4 clones que presentaban,
Cebador Secuencia Mut.
cada uno, una de las 4 mutaciones
FWE137D ATCTGATTATGCGTGATACAAAATG -
anteriormente seleccionadas. La introducción
BKE137D CCGTCTTGTCATCAATCGCC T → A
FWD323N CTTCTGGCGTATTATCGGGC - correcta de dichas mutaciones fue comprobada
BKD323N GAATTCTTGGGCTGAAGCTCTG C → T por secuenciación.
FWS15L AAAATAGGTGCGGCAGTGC -

BKS15L GAACAAATTGGCATAAGATGCAG G → A
FWM93V AAGATGCTTCCGGGGGAACG -
2.3.4 Purificación de las xilanasas
BKM93V CAAACACCCAAGCCGGCGTC T → C
mutantes
Figura IV.2.13: Cebadores utilizados para la
mutagénesis dirigida de xynB. A partir de los cuatro clones con las
mutaciones simples introducidas en xynB y del
Los plásmidos mutagenizados obtenidos tras
clon con el gen xynB salvaje (E. coli
amplificación y religación (pGEM-Te-
DH5α/pGEM-Te-X20), se hicieron cultivos en
X20E137D, pGEM-Te-X20D323N,
2 litros de medio LB con ampicilina

(1) Gel Filtración

mAU mS/cm

2500
30.0
SDS-PAGE
2000
25.0
kDa
1500
20.0
200 -

1000
116 -
15.0 97 -
500 66 -
10.0

0
0 50 100 150 ml
45 -

(2) Intercambio Iónico

mAU mS/cm
31 -

80.0
2000

70.0
21 -
1500 60.0

50.0

1000 40.0

30.0 0 1 2
500
20.0

10.0
0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 ml

Figura IV.2.14: Cromatogramas (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) de los resultados de purificación de la

xilanasa XynB salvaje mediante gel filtración (1) e intercambio iónico (2), a partir de extractos celulares
concentrados precipitados con sulfato amónico (0). En los cromatogramas, se muestra la absorbancia a
280 nm en azul y la conductividad en marrón.
128

100 μg/ml, de los que se obtuvieron los (Tabla IV.2.5) y se analizaron las distintas
extractos celulares correspondientes por fracciones mediante SDS-PAGE
French Press. (Figura IV.2.15) para comprobar el grado de
Los extractos celulares fueron clarificados, purificación obtenido para las diferentes
precipitados con sulfato amónico y enzimas.
concentrados para someterlos a continuación a
kDa
un proceso de purificación mediante
116 -
cromatografía en columna de 2 etapas 97 -
66 -
(Figura IV.2.14):
45 -
– Una primera etapa de gel filtración que
permitía eliminar la mayoría de proteínas 31 -

diferentes a XynB, especialmente aquellas

21 -
de peso molecular elevado.
– Una segunda etapa de intercambio 0 1 2 3 4 5

aniónico que permitía obtener la proteína
XynB con un alto grado de pureza.
En algunos casos, para eliminar totalmente
algunas proteínas de bajo peso molecular que
coeluían con XynB en el segundo paso de
intercambio aniónico, fue necesario recurrir a
una última etapa de purificación, en la que se
utilizaba una segunda columna
filtración de menor diámetro de poro y mayor
resolución que la usada en la primera etapa.
Durante todos las etapas de purificación se
determinó la actividad específica
Figura IV.2.15: Análisis por SDS-PAGE de las
xilanasas purificadas: (1) XynB salvaje, (2) XynB
E137D, (3) XynB D323N, (4) XynB S15L, (5)
XynB M93V. (0) Extractos celulares precipitados
con sulfato amónico de E. coli DH5α/pGEM-Te-
X20.
2.3.5 Termoestabilidad de las xilanasas
mutantes
de gel Para analizar la termoestabilidad de las
xilanasas purificadas, se ensayó la actividad
enzimática residual sobre pNPX tanto de las
variantes mutantes de XynB como de la
xilanasa salvaje, tras diferentes tiempos de
preincubación a 45 ºC y a 50 ºC.

Tabla IV.2.5: Actividad específica (U/mg de proteína) de XynB salvaje y las variantes mutantes a lo largo
de las diferentes etapas del proceso de purificación.

XynB salvaje XynB E137D XynB D323N XynB S15L XynB M93V
Extracto precipitado 0,089 0,002 0,142 0,134 0,298
Gel filtración 1 0,660 0,101 2,007 0,520 1,204
Intercambio aniónico 0,687 0,292 2,395 1,090 1,476
Gel filtración 2 2,776 1,314
 129

En los ensayos a 45 ºC, la gráfica obtenida al 50 ºC de la enzima con la mutación M93V fue
representar el logaritmo neperiano del más de 3 veces superior a la de la xilanasa
porcentaje de actividad residual en relación al salvaje, mientras que la xilanasa mutante S15L
tiempo de preincubación, mostró como las presentó a 50 ºC una vida media 5 veces
xilanasas mutantes presentaban una mayor superior a la de la enzima salvaje.
termorresistencia que la enzima salvaje,
destacando especialmente las variantes que
2.3.6 Obtención de dobles mutantes
presentaban las mutaciones M93V y S15L
(Figura IV.2.16). Tras los resultados obtenidos, se propuso
incrementar la termorresistencia de la
5,00
xilanasa B combinando las diferentes
4,00 mutaciones entre sí. Para ello se crearon 2
ln (% Actividad)

3,00
xilanasas dobles mutantes:
XynB (wt)
– Una que contenía simultáneamente las
2,00 M93V
S15L mutaciones E137D y D323N, provenientes
1,00 E137D
D323N
0,00
0 5 10 15 20 25 30 5,00

Tiempo de incubación a 45 ºC (min)

4,00
ln (% Actividad)

Figura IV.2.16: Gráfica de termoestabilidad a 3,00

45 ºC de la xilanasa B salvaje y 4 de sus variantes
mutantes. 2,00
XynB (wt)
1,00
M93V
Al repetir el ensayo de termoestabilidad con S15L
estas dos últimas xilanasas, esta vez 0,00
0 4 8 12 16
preincubando a 50 ºC, se observó como las
Tiempo de incubación a 50 ºC (min)
diferencias de termoestabilidad respecto a la
enzima salvaje se hacían aún más apreciables Figura IV.2.17: Gráfica de termoestabilidad a
50 ºC de la xilanasa B salvaje y las xilanasas
(Figura IV.2.17). mutantes XynB M93V y XynB S15L.
Estos resultados se observan mejor al calcular Tabla IV.2.6: Vida media, en minutos, de XynB y
la vida media, en minutos, de estas enzimas las xilanasas mutantes.

(Tabla IV.2.6). 45 ºC 50 ºC
XynB (wt) 9,1 1,8
Se observó así que a 45 ºC todas las xilanasas XynB E137D 14,1 -
mutantes presentaban una vida media superior XynB D323N 11,2 -
a la xilanasa salvaje, hecho que se hizo más XynB S15L 17,6 9,1

patente a 50 ºC. En concreto, la vida media a XynB M93V 35,8 7,1

130

las dos del mismo clon mutante original y otro de 1723 bp sin mutaciones; mientras
(clon 30). que a partir de pGEM-Te-X20M93V el
– Una segunda xilanasa doble mutante con fragmento resultante de 3082 bp no contenía
las 2 mutaciones que conferían mutaciones y era el fragmento de 1723 bp el
individualmente mayor termorresistencia, que contenía la mutación M93V.
M93V y S15L. La ligación de los 2 fragmentos que contenían
las mutaciones (el de 3082 bp con la mutación
Para obtener la doble mutante E137D/D323N, S15L y el de 1723 bp con la mutación M93V),
se partió del plásmido pGEM-Te-X20D323N, dio lugar al plásmido pGEM-Te-
sobre el cual se introdujo la mutación E137D X20S15L+M93V (Figura IV.2.18).
mediante mutagénesis dirigida, utilizando la NaeI lacZ NaeI lacZ

técnica de amplificación por PCR divergente f1 ORI xynBS15L f1 ORI xynBM93V

M93V
en un sólo paso y los cebadores FWE137D y pGEM-Te-X20S15L
NaeI
pGEM-Te-X20M93V
4,8 Kb 4,8 Kb NaeI
S15L
BKE137D ya utilizados previamente para AmpR AmpR
SpeI SpeI

introducir las mutaciones simples

(Figura IV.2.13).
NaeI NaeI lacZ

f1 ORI

Para obtener la doble mutante S15L/M93V se 3,1 Kb

M93V

NaeI 1,7 Kb NaeI

aplicó la metodología anterior (mutagénesis AmpR
S15L

SpeI
dirigida por PCR divergente en un sólo paso),
tanto para introducir la mutación S15L en el
plásmido pGEM-Te-X20M93V, como a la lacZ
NaeI

inversa, para introducir la mutación M93V en f1 ORI xynBS15L+M93V

pGEM-Te-X20S15L; pero no se obtuvieron 4,8 Kb

M93V

NaeI

resultados positivos. Amp R

S15L

SpeI

pGEM-Te-X20S15L+M93V
La alternativa que se utilizó finalmente fue
dividir en dos fragmentos tanto el plásmido Figura IV.2.18: Obtención del plásmido
pGEM-Te-X20S15L+M93V por restricción y
pGEM-Te-X20S15L como el pGEM-Te- ligación.
X20M93V utilizando la enzima de restricción
Los dos nuevos plásmidos construidos,
NaeI, que posee una diana en el gen xynB
pGEM-Te-X20E137D+D323N y pGEM-Te-
localizada entre las mutaciones S15L y M93V,
X20S15L+M93V, fueron transformados en
y otra diana en el vector pGEM-Te. En el caso
E. coli, dando lugar a los clones E. coli
de pGEM-Te-X20S15L se generó un
fragmento de 3082 bp, con la mutación S15L,
 131

DH5α/pGEM-Te-X20E137D+D323N y evidenciaron el grado de pureza de las enzimas

E. coli DH5α/pGEM-Te-X20S15L+M93V.
La correcta introducción de las 2 mutaciones
en cada uno de los clones construidos fue
comprobada mediante secuenciación.
2.3.7 Purificación y ensayos
termoestabilidad de las xilanasas
dobles mutantes
A partir de los clones E. coli DH5α/pGEM-Te-
X20E137D+D323N y E. coli
DH5α/pGEM-Te-X20S15L+M93V
procedió a purificar las xilanasas dobles
mutantes utilizando la misma metodología
descrita en el apartado 2.3.4.
La determinación de la actividad específica a
lo largo de las etapas de purificación y el
obtenidas.
Para determinar la termoestabilidad de estas
nuevas xilanasas purificadas, se ensayó su
actividad enzimática residual sobre pNPX tras
diferentes tiempos de preincubación a 50 ºC.
de
Los resultados de termoestabilidad obtenidos
mostraron claramente como la xilanasa doble
mutante S15L/M93V presentaba una
termorresistencia muy superior a la de la
enzima salvaje, mientras que la doble mutante
se E137D/D323N no mostró grandes diferencias
respecto a la termoestabilidad de la xilanasa
salvaje (Figura IV.2.20).
5,00
4,00
ln (% Actividad)

análisis por SDS-PAGE (Figura IV.2.19), 3,00

XynB (wt)
2,00 M93V
S15L
1,00 S15L/M93V
kDa
E137D/D323N
0,00
116 -
97 - 0 4 8 12 16

66 - Tiempo de incubación a 50 ºC (min)

45 - Figura IV.2.20: Gráfica de termoestabilidad a

50 ºC de la xilanasa B salvaje, las dobles mutantes
S15L/M93V y E137D/D323N, y las mutantes
simples M93V y S15L.
31 -

La comparación de la termoestabilidad de la
21 - doble mutante S15L/M93V con la de las
xilanasas mutantes simples de las que deriva,
0 1 2 3
mostró que la doble mutante presentaba una
Figura IV.2.19: Análisis por SDS-PAGE de las termorresistencia notablemente aumentada
xilanasas dobles mutantes purificadas. (1) XynB
salvaje, (2) XynB E137D+ D323N, (3) XynB (Figura IV.2.20).
S15L+M93V, (0) extractos celulares precipitados
con sulfato amónico de E. coli DH5α/pGEM-Te-
X20.
132

La vida media de la doble mutante 2.3.8 Efectos de las mutaciones sobre

S15L/M93V resultó muy superior a la vida la estructura de XynB
media de las mutantes simples S15L y M93V Con el fin de averiguar si las diferentes
originales (Tabla IV.2.7), observándose un mutaciones encontradas podían producir
efecto sinérgico de estas dos mutaciones, lo cambios en la estructura tridimensional de la
cual confería a la doble mutante S15L/M93V enzima, se localizó la situación dichas
una vida media a 50 ºC aproximadamente 20 mutaciones en la estructura tridimensional de
veces superior a la de la xilanasa salvaje. la xilanasa salvaje.
Tal como se puede observar en la
Tabla IV.2.7: Vida media en minutos de XynB y
las mutantes simples y dobles analizadas. Figura IV.2.21, todas las mutaciones se
encontraban en regiones superficiales del
plegamiento, relativamente alejadas del centro
50 ºC
XynB (wt) 1,8 activo. Esta localización periférica hacía
XynB E137D/D323N 2,2 suponer la ausencia de cambios importantes en
XynB S15L 9,1
la estructura tridimensional y en la función.
XynB M93V 7,1
XynB S15L/M93V 37,7
Para comprobar si estas mutaciones producían
o no cambios significativos en la estructura
secundaria de la enzima que permitieran

E137D

E134

M 93V

E241

S15L
D323N

Figura IV.2.21: Localización de las mutaciones (en azul) y los residuos catalíticos (en rojo) en la estructura
tridimensional de la xilanasa B.
 133

XynB (wt) 30 ºC
0 XynB (wt) 40 ºC
XynB (wt) 50 ºC
CD (mgrados)

XynB (wt) 60 ºC

XynB S15L/M93V 30 ºC
XynB S15L/M93V 40 ºC
-5 XynB S15L/M93V 50 ºC
XynB S15L/M93V 60 ºC

-8
200 220 240 260
Longitud de onda (nm)

Figura IV.2.22: Gráfica de dicroísmo circular de XynB salvaje y la doble mutante S15L/M93V a 30, 40, 50
y 60 ºC de temperatura.

explicar el aumento de termorresistencia, se xilanasa B salvaje, de las dos mutantes simples

hicieron análisis por dicroísmo circular a más termoestables (mutaciones S15L y M93V)
diferentes temperaturas de la xilanasa B y de las dos dobles mutantes, sobre
salvaje y de la doble mutante S15L/M93V, por concentraciones crecientes de pNPX
ser esta la más termoestable de entre las (Figura IV.2.23).
mutantes.

3,2
Los resultados obtenidos (Figura IV.2.22), no
Velocidad (U/ml)

2,6
mostraron variaciones significativas alrededor
de los 220 nm que permitieran inferir posibles 2,0

diferencias en la estructura secundaria. Se 1,4

observaron, sin embargo, ligeras diferencias en

0,8
la desviación de la luz entre los 228 y los
0,2
240 nm. 0 2 4 6 8 10
Concentración pNPX (mM)

XynB (wt) E137D/D323N

2.3.9 Estudio de las constantes M93V M93V/S15L
S15L
cinéticas de XynB y de las xilanasas
Figura IV.2.23: Gráfica de las cinéticas
mutantes enzimáticas de la xilanasa B salvaje y las xilanasas
mutantes.
Se determinaron a continuación los valores de
las constantes cinéticas VMáx y KM sobre
pNPX, evaluando para ello la actividad de la
134

Tabla IV.2.8: Parámetros cinéticos de XynB y las xilanasas mutantes.

VMáx KM [E]Total KCAT KCAT/KM
(U/ml) (mM) (μmol/ml) (ms-1) (ms-1mM-1)
XynB (wt) 1,451 2,384 186,193 0,130 0,054
XynB S15L 0,877 1,820 12,652 1,155 0,635
XynB M93V 3,395 1,712 48,077 1,177 0,688
XynB E137D/D323N 2,938 2,495 30,491 1,606 0,644
XynB S15L/M93V 3,260 1,497 59,464 0,914 0,610

El cálculo de las constantes cinéticas a partir

de las gráficas (Tabla IV.2.8), no mostró
grandes diferencias respecto a la xilanasa
salvaje en cuanto a la afinidad (1/KM) aunque
sí que se apreciaba un ligero aumento de ésta
en el caso de las mutantes más
termorresistentes.
Por el contrario los valores de velocidad
máxima (VMáx) mostraban una alta
variabilidad, pero al corregir por la
concentración total de enzima ([E]Total), la
constante catalítica (KCAT) resultante fue muy
similar entre todas las xilanasas mutantes, que
presentaron valores muy superiores a los de la
xilanasa B salvaje.

Resultados similares se obtuvieron al calcular

la eficacia catalítica (KCAT/KM). Todas las
xilanasas mutantes presentaron valores
similares de eficiencia catalítica, que fueron a
su vez muy superiores a la eficiencia catalítica
de la xilanasa B salvaje.
ANEXO I.
APLICACIÓN DE LAS XILANASAS ESTUDIADAS

EN EL BLANQUEO DE LA PASTA DE PAPEL


1. - INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Tal como se ha comentado con anterioridad en
este trabajo, una de las principales
aplicaciones industriales de las xilanasas hoy
día se da en la industria papelera. El
tratamiento con xilanasas de la pasta de papel,
previo al blanqueo químico, hace mucho más
eficiente el proceso de blanqueo, lo que reduce
las necesidades de blanqueantes clorados para
obtener el mismo grado de blancura y calidad
en la pasta de papel, generándose como
consecuencia una menor cantidad de residuos
organoclorados, de elevada toxicidad
ambiental (Bajpai, 2004).
Por este motivo se decidió probar la idoneidad
o no de los enzimas estudiados en este trabajo
para potenciar el blanqueo de la pasta de
papel.
Los ensayos papeleros fueron realizados por
Cristina Valls, del grupo de Ingeniería
Papelera de la Universitat Politècnica de
Catalunya (UPC), bajo la dirección de la
Doctora Mª Blanca Roncero.
En base a esto, los objetivos de este apartado
fueron:
- La producción de las xilanasas XynA
(familia 11) e YnfF (familia 5) de
Bacillus sp. BP-7, y XynB (familia 10) de
Paenibacillus barcinonensis, en cantidad
suficiente para su ensayo en laboratorio
papelero.
- La cuantificación de la actividad xilanasa
producida, en las condiciones de los
137
ensayos papeleros posteriores, y su
suministro al grupo de Ingeniería Papelera
de la UPC para su evaluación en el
blanqueo de pastas kraft de Eucalyptus
globulus.
2. - RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.1. Producción en fermentador
de las xilanasas a evaluar
A partir de las cepas E. coli/pXA30 (ver
capítulo I de Resultados), E. coli DH5α/
pMSR8SPO2-ynfF (ver capítulo II de
Resultados) y E. coli 5K/pX20 (Blanco et al.,
1996) se prepararon cultivos de 500 ml, en
medio LB suplementado con ampicilina
100 μg/ml, que se incubaron a 37 ºC toda la
noche.
10 ml de cada uno de estos cultivos fue
utilizado para verificar la actividad xilanasa,
mediante el ensayo enzimático sobre xilano de
madera de abedul. Una vez comprobada esta
actividad, el resto de los cultivos iniciales
(490 ml) se utilizó como inóculo de cultivos en
50 l de medio LB preparado y esterilizado en
el fermentador B. Braun Biotech - Sartorius
del servicio de fermentación de la Universitat
de Barcelona; medio que se suplementó con
ampicilina 100 μg/ml esterilizada por filtración
antes de ser inoculado.
Tras incubaciones de 15 h a 37 ºC, se
recogieron las células por centrifugación en
una centrífuga clarificadora Westfalia CSA
1-06-475 (con tambor de platos y esterilizable
138

por vapor) del servicio de fermentación. Las La actividad xilanasa obtenida para cada
células obtenidas fueron concentradas enzima, junto a las condiciones de ensayo, se
adicionalmente por centrifugación en una detallan en la Tabla AN1.2.1.
centrífuga Beckman high-speed, se
resuspendieron en 100 ml de tampón Tris-HCl Las muestras de xilanasas fueron alicuotadas
100 mM pH 7, se sometieron a lisis mediante en tubos de 10 ml, se congelaron a -20 ºC y se
French Press, y a continuación se enviaron en frío al grupo de Ingeniería
centrifugaron los lisados obtenidos para Papelera de la UPC, donde se realizaron los
recuperar los sobrenadantes, que contenían las ensayos papeleros.
enzimas.

2.3. Ensayos papeleros

2.2. Determinaciones de actividad
2.3.1. Características de las pastas
enzimática
papeleras
Una vez obtenidos los extractos celulares
La materia prima que se utilizó para los
concentrados, se ensayó la actividad xilanasa
ensayos fue pasta kraft de Eucalyptus globulus
de los mismos mediante ensayo enzimático
(pasta de maderas duras, ricas en xilano),
sobre xilano de madera de abedul en las
previamente deslignificada con oxígeno.
condiciones de pH y temperatura adecuadas en
Se emplearon dos tipos de pastas de eucalipto,
cada caso para su aplicación en las pastas
ambas de procedencia industrial y producidas
papeleras.
por la empresa Torraspapel S.A.:
Generalmente estas condiciones no eran las
– Pasta 1: pasta tal cual era proporcionada
óptimas para las xilanasas, pero sí eran
por Torraspapel S.A., sin lavar
aquellas que permitían que las enzimas
posteriormente en el laboratorio. Esta pasta
mantuvieran un alto porcentaje de actividad
contenía gran cantidad de xilooligómeros,
durante las 2 h de duración de los tratamientos
hecho que suele dificultar el análisis del
enzimáticos de las pastas, manteniendo bajos
efecto de las xilanasas sobre ellas.
los niveles de inactivación.

Tabla AN1.2.1: Condiciones de ensayo y actividad de las xilanasas obtenidas por fermentación.

Actividad
Xilanasa Clon Temperatura pH (U/ml extracto)
XynA de Bacillus sp. BP-7 E. coli/PXA30 50 ºC 7 46,5
E. coli DH5α/
YnfF de Bacillus sp. BP-7 60 ºC 7 91,8
pMSR8SPO2-ynfF
XynB de Paenibacillus barcinonensis E. coli 5K/pX20 40 ºC 8 30,2
 139

– Pasta 2: pasta lavada en el laboratorio con – Fase D: blanqueo con dióxido de cloro
tampón Tris-HCl pH 7 durante 30 min a (equivalente a 3% de Cl2 activo).
temperatura ambiente. Este lavado – Fase P: blanqueo con peróxido de
permitía eliminar los xilooligómeros. hidrógeno (1,5% de NaOH, 3% de H2O2).

Tabla AN1.2.3: Condiciones de aplicación de las

Las características iniciales de estas pastas se xilanasas en la fase X de la secuencia XDP.
resumen en la Tabla AN1.2.2:
Dosis Temp. Tiempo
Tabla AN1.2.2: Características iniciales de las Enzima (U/gps) (ºC) pH Tampón (h)
pastas papeleras utilizadas. C- 0 40 - 60
YnfF 60 7 Tris-HCl
2
Pasta 1 Pasta 2 XynA 2 50 50 mM
Índice kappa 9,2 8,0 XynB 40 8
Blancura (%ISO) 50,2 51,1
Viscosidad (ml/g) 958±24 972±20
Las xilanasas XynA e YnfF de Bacillus sp.
El índice kappa es una medida de la cantidad
BP-7 se evaluaron sobre pasta 1, y la xilanasa
de lignina, responsable del color marrón de la
XynB de Paenibacillus barcinonensis sobre
pasta de papel. Se determinó según la norma
pasta 2.
ISO 302.
El porcentaje de blancura ISO es una medida
Los resultados obtenidos en el índice kappa
del grado de blanco de un papel, expresado
(Ik) y el porcentaje de blancura ISO
como porcentaje respecto a un blanco
(Bl % ISO), determinados al final de la
normalizado (el del óxido de magnesio =
secuencia de blanqueo, se resumen en la
100%). Se determinó según la norma
Tabla AN1.2.4:
ISO 5351/1.
Tabla AN1.2.4: Resultados finales de la secuencia
de blanqueo XDP.

2.3.2. Secuencia de blanqueo XDP

Pasta Ik Bl (% ISO)
Para la evaluación del efecto de las xilanasas C- 2,6 89,2
sobre las pastas papeleras se utilizó en primer YnfF 1 2,2 90,6
lugar una secuencia parcial de blanqueo ECF XynA 2,0 90,2
C- 2,5 89,4
(elemental chlorine free). 2
XynB 2,4 89,4
En concreto se utilizó una secuencia XDP, que
consta de 3 etapas: Tal como se puede observar los tratamientos
– Fase X: pretratamiento enzimático con con XynA e YnfF permitieron obtener un
xilanasa (Tabla AN1.2.3). aumento de 1 - 1,4% en la blancura final
140

respecto al control –, y una reducción de Las dos enzimas seleccionadas y el control se

0,4 - 0,6 puntos en el índice kappa evaluaron sobre pasta 2.
(relacionado con la cantidad de lignina Los resultados que se obtuvieron para el índice
residual). Por el contrario, la aplicación de la kappa y el porcentaje de blancura ISO tras el
xilanasa XynB no produjo mejoras apreciables tratamiento enzimático y al final de la
en las propiedades del papel. secuencia de blanqueo se resumen en la
Tabla AN1.2.6:

2.3.3. Secuencia de blanqueo XDEOPD1 Tabla AN1.2.6: Resultados tras el tratamiento

enzimático (fase X) y al final de la secuencia
A partir de los resultados con la secuencia completa de blanqueo XDEOPD1.
XDP se seleccionaron las xilanasas XynA e
X XDEOPD1
YnfF de Bacillus sp. BP-7 para proceder a la
Ik Bl(% ISO) Ik Bl(% ISO)
realización de una secuencia completa de
C - 7,9 51,8 0,8 89,3
blanqueo ECF. Se utilizó la secuencia YnfF 7,8 52,3 0,7 89,4
XDEOPD1, que consta de 4 etapas: XynA 7,9 54,5 0,5 90,4
– Fase X: pretratamiento enzimático con
Se observó que, por un lado, a pesar de que el
xilanasa (Tabla AN1.2.5). Se aumentaron
índice kappa es inferior al del control en
las dosis de enzimas respecto a la
ambos tratamientos enzimáticos, las
secuencia XDP para acentuar los efectos
diferencias son en general pequeñas (menores
de éstas.
o iguales a 0,3 puntos).
– Fase D: blanqueo con dióxido de cloro
En cuanto a la blancura final de las pastas,
(equivalente a 3% de Cl2 activo).
mientras la xilanasa A causó un incremento de
– Fase EOP: extracción alcalina con oxígeno
ésta en 1,1%, YnfF causó un aumento de
y peróxido de hidrógeno (1,1% de NaOH,
blancura del 0,1%, muy discreto respecto al
0,3% de H2O2).
control sin enzima.
– Fase D1: nueva fase de blanqueo con
Sin embargo, la determinación de la blancura
dióxido de cloro, pero en menor cantidad
tras las distintas etapas de blanqueo mostraba
(equivalente a 1,25% de Cl2 activo).
que a medida que se avanzaba en la secuencia
Tabla AN1.2.5: Condiciones de aplicación de las de blanqueo, las diferencias de blancura
xilanasas en la fase X de la secuencia XDEOPD1.
respecto al control se reducían (datos no

Dosis Temp. Tiempo mostrados). Esto podía ser debido a que las
Enzima (U/gps) (ºC) pH Tampón (h) elevadas dosis de blanqueantes químicos
C- 0
YnfF 50 7
Tris-HCl
2
empleadas permiten por sí solas que se
3 50 mM
XynA
 141

alcancen valores de blancura muy elevados, y estudiadas en nuevas secuencias ECF y en

por tanto muy difíciles de mejorar. secuencias TCF (total chlorine free), así como
Estos resultados indican que la aplicación de su contribución a la disminución de la dosis de
estas enzimas, al menos en el caso de la blanqueantes (especialmente derivados
xilanasa A, permitirían reducir los niveles de clorados) y la consecuente reducción en la
blanqueantes químicos a utilizar generación de AOX (Compuestos Orgánicos
(especialmente el dióxido de cloro) para Halogenados), altamente contaminantes.
obtener una blancura determinada;
consiguiéndose así una reducción de los
residuos tóxicos generados durante el proceso.

También se hicieron ensayos de la cantidad de

ácidos hexenurónicos (HexA) presentes en las
pastas tratadas con xilanasas. Estos HexA se
generan durante el proceso de cocción kraft a
partir de los grupos de ácido
4-O-metil-α-D-glucurónico presentes en los
xilanos y son responsables en gran medida del
envejecimiento o amarilleamiento del papel
(Buchert et al., 1997).
Los resultados obtenidos hasta el momento
indican que la aplicación tanto de YnfF como
de XynA de Bacillus sp. BP-7 reducen las
cantidades de HexA en las pastas.

El conjunto de resultados papeleros obtenidos

muestran, por una parte la diferente
efectividad de las xilanasas bacterianas para su
aplicación en el blanqueo de pastas de papel, y
por otra parte han permitido identificar dos
nuevas xilanasas potenciadoras del blanqueo
de pastas kraft de eucalipto.
En el momento actual se están llevando a cabo
nuevos ensayos para cuantificar la efectividad
potenciadora del blanqueo de las enzimas
DISCUSIÓN
 145

máxima actividad sobre xilano de madera de

1. XILANASAS DE BACILLUS SP. haya, además de presentar actividad sobre
BP-7 otros glucuronoxilanos y arabinoxilanos,
observándose una actividad decreciente a
Con el objetivo de clonar e identificar nuevos
medida que aumenta el grado de sustitución de
genes de xilanasas se construyó una genoteca
los xilanos. No se detectó actividad de XynA
de Bacillus sp. BP-7. Esta cepa había sido
sobre celulosas (CMC o Avicel), y su
aislada y caracterizada bioquímicamente en el
actividad sobre polisacáridos diferentes del
grupo de investigación (López et al., 1998), y
xilano y sobre los aril-glicósidos ensayados
fue escogida por presentar una elevada
fue muy baja.
actividad xilanasa.
A partir de la genoteca construida se aislaron
El peso molecular teórico de la xilanasa A de
seis clones capaces de degradar xilano. Cuatro
Bacillus sp. BP-7 es de 23,5 kDa, lo cual
de estos clones poseían alta actividad y
concuerda con el peso molecular aparente en
codificaban la misma xilanasa, que se
los zimogramas de extractos de la cepa
denominó xilanasa A (XynA). Los otros dos
recombinante E. coli/pXA30 (23-24 kDa).
clones eran idénticos y poseían menor
Esta enzima debe corresponder a la xilanasa
actividad. El inserto de los mismos incluía 2
mayoritaria de Bacillus sp. BP-7, previamente
pautas abiertas de lectura que codificaban
identificada en los análisis electroforéticos de
proteínas homólogas a xilanasas, las cuales se
sobrenadantes de esta cepa (López et al.,
denominaron XynD e YnfF, respectivamente.
1998). Dichos análisis, sin embargo, indicaban
Las 3 xilanasas de Bacillus sp. BP-7 fueron
un peso molecular de 22 kDa para esta enzima.
clonadas de manera independiente, fueron
La diferencia en cuanto al peso molecular se
secuenciadas, y dos de ellas, XynA e YnfF,
debería a que la proteína deducida a partir de
fueron caracterizadas bioquímicamente
xynA presenta un péptido señal de 28
(capítulos I y II de Resultados).
aminoácidos (comprobado mediante los
programas SignalP y PSort), el cual no sería
1.1.- Identificación y procesado en el clon recombinante
Escherichia coli/pXA30, mientras que en la
caracterización de XynA
enzima detectada en sobrenadantes de la cepa
Los resultados de especificidad de sustrato
parental Bacillus sp. BP-7 este péptido señal
obtenidos para XynA (Tabla I.2.3) indican
sería eliminado durante la secreción al medio.
claramente que esta enzima es una
El punto isoeléctrico (pI) teórico de 9,28
endoxilanasa (1,4-β-D-xylan
deducido para esta xilanasa se vio corroborado
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8) que presenta
146
también por los resultados experimentales en
geles de isoelectroenfoque (pI de 9 o superior).
Las condiciones óptimas de actuación de
XynA fueron determinadas, siendo estas 60 ºC
de temperatura y pH 6, aunque mantiene un
porcentaje elevado de actividad en márgenes
amplios alrededor de estos valores (de 40 a
70 ºC y pH de 4,5 a 8,5).
En cuanto a la termoestabilidad de la enzima, a
50 ºC es de como mínimo 3 h, inactivándose
rápidamente a 60 ºC. En base a ésto, la enzima
no plantearía problemas a la hora de su
mantenimiento y almacenamiento, sin
embargo no soportaría las altas temperaturas
de algunos procesos industriales, de manera
que para su utilización en este tipo de procesos
biotecnológicos podría ser interesante
someterla a ensayos de evolución dirigida para
incrementar su termoestabilidad.
Los análisis de secuencia revelaron que XynA
de Bacillus sp. BP-7 es una enzima de dominio
único con una alta homología con el subgrupo
de xilanasas, dentro de la familia 11 de
glicosil hidrolasas, de pI alcalino y bajo peso
molecular (92% de identidad con la xilanasa A
de Bacillus subtilis y con la xilanasa A de
Bacillus circulans; Figura I.2.4). Este tipo de
xilanasas parece ser ubicuo entre las especies
del género Bacillus y ha sido propuesto como
el principal subgrupo de enzimas de la familia
11 de glicosil hidrolasas (Wong et al., 1988).
De esta manera, tal como era de esperar, las
características bioquímicas (pH y temperaturas
óptimos, especificidad de sustrato, etc.) de
XynA de Bacillus sp. BP-7 son similares a las
de las xilanasas mencionadas, las cuales están
exhaustivamente caracterizadas (Paice et al.,
1986; Yang et al., 1989; Wakarchuk et al.,
1994; Wolf et al., 1995).
También se ha observado que la composición
G+C en la primera y segunda posición de
codón de xynA de Bacillus sp. BP-7 es del
38,2% y del 52,1% respectivamente.
Porcentajes similares se obtienen para xynA de
B. circulans y para xynA de B. subtilis (38,3%
en G+C para la primera posición y 52,8% para
la segunda), mientras que los porcentajes
promedio para estas posiciones de codón en
los genes de glicosil hidrolasas de B. subtilis
son de 51,7% y 37,7%. Este hecho, sugiere
que la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7
corresponde a una enzima altamente
conservada en este género y adquirida por
transferencia horizontal de genes, mediada
en este caso por el profago 6, tal como
sugieren García-Vallvé y colaboradores
(1999).
1.2.- Identificación y
caracterización de YnfF
YnfF de Bacillus sp. BP-7 presenta alta
homología con la proteína deducida del gen
ynfF de Bacillus subtilis ssp. subtilis cepa 168,
identificada en el Proyecto Genoma de
Bacillus subtilis (Kunst et al., 1997) y anotada
originalmente como una proteína de función
desconocida homóloga a endoxilanasas; pero
que recientemente ha sido caracterizada y
 147

renombrada como XynC (St. John et al., EC 3.2.1.8) que hidroliza xilanos de maderas
2006b). duras (tales como xilano de madera de abedul,
En cuanto a la función de ynfF de Bacillus sp. de haya y metil glucuronoxilano),
BP-7, hemos comprobado que codifica una obteniéndose los valores más altos de
endoxilanasa. Sin embargo, YnfF es una actividad sobre xilano de madera de abedul.
xilanasa atípica en el sentido de que no Por el contrario, la enzima no presenta
pertenece ni a la familia 10 ni a la familia 11, a actividad detectable sobre xilanos de
las que pertenecen la mayoría de gramíneas (xilano de espelta de avena,
endoxilanasas, ya que no presenta homología arabinoxilano de trigo, arabinoxilano de
con estas familias. YnfF presenta homología centeno), y su actividad tampoco es detectable
con enzimas con actividad xilanasa que a su o significativa sobre los aril-glicósidos
vez son homólogas a enzimas de la familia 5 ensayados.
de glicosil hidrolasas (Keen et al., 1996; Estos resultados indican que la xilanasa YnfF
Suzuki et al., 1997). Asimismo, YnfF presenta tiene actividad sobre xilanos con
homología a nivel de secuencia con un ramificaciones de ácido metil glucurónico
dominio conservado de glicosil hidrolasas de (glucuronoxilanos) pero es inactiva sobre
la familia 30, hecho descrito también para xilanos con ramificaciones de arabinosa
otras enzimas de la familia 5 (Collins et al., (arabinoxilanos); lo cual es coherente con el
2005). A pesar de que su estructura modo de acción descrito para xilanasas de la
tridimensional es el típico barril (α/β)8 de las familia 5 de glicosil hidrolasas.
enzimas de la familia 5, las xilanasas de esta Recientes estudios han demostrado que estas
familia son muy similares en secuencia de xilanasas de la familia 5 sólo cortan la cadena
aminoácidos a glicosil hidrolasas de la de xilosas del xilano en aquellos puntos
familia 30, cuya estructura, inferida a partir de cercanos a una ramificación lateral de ácido
la β-glucosidasa ácida 1 de Homo sapiens, 4-O-metil-α-D-glucurónico, la cual quedaría
sería también de barril (α/β)8 (Lieberman et acomodada en el subsitio -2 del centro activo.
al., 2007). Los productos resultantes de este modo de
YnfF de Bacillus sp. BP-7 es por tanto una de acción son fragmentos de xilano que,
las pocas xilanasas descritas dentro de la independientemente de su longitud, contienen
familia 5 de glicosil hidrolasas. esta ramificación lateral de ácido
metil glucurónico en el segundo residuo de
Tal como se ha comentado, los resultados de xilopiranosa contando desde el extremo
especificidad de sustrato obtenidos para YnfF reductor (St. John et al., 2006b; Vršanská et
(Tabla II.2.2) indican que esta enzima es una al., 2007) (Figura D.1.1).
endoxilanasa (1,4-β-D-xylan xylanohydrolase;
148

Figura D.1.1: Esquema del modo de actuación de las xilanasas de la familia 5.

La falta de actividad de estas xilanasas sobre de identidad a nivel de secuencia

arabinoxilanos sugeriría la imposibilidad aminoacídica).
estérica de acomodar residuos de
α-L-arabinofuranosa en los subsitios del centro La termoestabilidad de YnfF fue muy elevada
activo de la enzima. (>3 h) a las temperaturas ensayadas de 60 y
50 ºC. Así, esta enzima no plantearía
La xilanasa YnfF de Bacillus sp. BP-7 tiene un problemas a la hora de su mantenimiento y
peso molecular teórico de 47,6 kDa, que almacenamiento.
concuerda con el peso molecular determinado
zimográficamente, 47 - 48 kDa, a partir de
extractos obtenidos de cepas recombinantes de 1.3.- Identificación de XynD
E. coli. Se ha comprobado además, mediante Hasta el momento, XynD de Bacillus sp. BP-7
los programas SignalP y PSort, que la sólo ha sido clonada y secuenciada, no
secuencia proteica deducida de ynfF presenta habiéndose caracterizado aún su actividad
péptido señal, hecho que indica que se trata enzimática.
de una enzima de secreción en la cepa original A nivel de secuencia de aminoácidos, presenta
de Bacillus sp. BP-7. alta homología con la xilanasa D (XynD) de
Bacillus subtilis (Kunst et al., 1997), la cual a
Las condiciones óptimas de actuación de YnfF pesar de haber sido secuenciada durante el
son 65 ºC de temperatura y pH 6,5, Proyecto Genoma de Bacillus subtilis no ha
presentando un porcentaje elevado de sido caracterizada bioquímicamente. También
actividad (>50%) en margenes amplios presenta homología elevada con XynD de
alrededor de estos valores (de 30 a 70 ºC y pH Paenibacillus polymyxa (Gosalbes et al.,
de 4,5 a 10). 1991) y otras enzimas que, además de
Estos valores además son muy similares a los actividad xilanasa, muestran actividad
de XynC de Bacillus subtilis 168 (St. John et arabinofuranosidasa, y que se encuentran
al., 2006b), lo cual era de esperar dado el alto clasificadas en la familia 43 de glicosil
grado de identidad entre ambas proteínas (92% hidrolasas, la cual engloba enzimas con
diferentes actividades hidrolíticas.
 149

Así, en este caso sería necesario caracterizar la
actividad enzimática de XynD de Bacillus sp.
BP-7, comprobando si realmente la proteína
clonada tiene actividad xilanasa, o si por el
contrario presenta alguna otra
actividades hidrolíticas relacionadas con la
degradación del xilano, xilosidasa
arabinofuranosidasa, exhibidas por enzimas de
la familia 43.
1.4.- Sistema xilanolítico
Bacillus sp. BP-7
Se han clonado e identificado entre 2 y 3
xilanasas de la cepa Bacillus sp. BP-7,
dependiendo de si consideramos sólo los genes
xynA e ynfF, o si finalmente se confirma XynD
como una auténtica xilanasa (Tabla D.1.1).
Sin embargo, en los zimogramas realizados a
partir de sobrenadantes de la cepa analizada
aparecen una gran variedad de bandas con
actividad xilanasa (López et al., 1998). Así,
podría ser que Bacillus sp. BP-7 presentara
más genes de xilanasas, aunque también
podría suceder que las bandas de actividad
detectadas en los zimogramas
agregados de la xilanasa mayoritaria (XynA) o
de las otras xilanasas caracterizadas en este
trabajo, así como productos de procesamiento
de las mismas. Dado que taxonómicamente
Bacillus sp. BP-7 se encuentra muy cercano a
de las Bacillus subtilis (López, 2000) y que la
homología de los genes de ambos hasta ahora
o comparados es bastante elevada, cabría esperar
que Bacillus sp. BP-7 tuviera un número de
xilanasas similar al de Bacillus subtilis.
A partir de consultas en la base de datos del
genoma de Bacillus subtilis (SubtiList) se
de deduce que éste posee sólo 2 genes conocidos
que codifiquen para xilanasas, xynA e ynfF
(recientemente renombrado como xynC),
cuyos homólogos en Bacillus sp. BP-7 se han
identificado en este trabajo. Bacillus subtilis
posee también otros 2 genes clasificados como
homólogos a endoxilanasas, pero aún no
confirmados experimentalmente, xynD e yheN,
de los cuales en Bacillus sp. BP-7 se ha
identificado y subclonado el homólogo a
xynD.
De esta manera, a parte de la caracterización
bioquímica de este último enzima, que se está
realizando actualmente en el grupo de
investigación, quedaría por analizar la
fueran existencia en Bacillus sp. BP-7 del gen
homólogo a yheN de Bacillus subtilis y por

Tabla D.1.1: Xilanasas de Bacillus sp. BP-7.

Peso Temperatura pH Vida media a

Gen Familia molecular pI óptima óptimo 50 ºC
xynA 11 23 - 24 kDa 9,28* 60 ºC 6,0 >3h
ynfF 5 47 - 48 kDa 8,80* 65 ºC 6,5 >3h
xynD 43 54,3 kDa* 7,73* - - -
*
Valores teóricos
150
caracterizar la presunta proteína codificada por
él.
1.5.- Expresión de xilanasas en
levaduras
En colaboración con el grupo del Dr. Jesús
Zueco de la Universitat de València, se ha
conseguido ensayar con éxito la expresión y
secreción de la xilanasa XynA de Bacillus sp.
BP-7 en Saccharomyces cerevisiae, como
primer paso para su posible utilización
biotecnológica en la industria alimentaria.
S. cerevisiae es un buen candidato para estos
ensayos ya que de forma natural no produce
xilanasas autóctonas (Jeffries, 1983), es un
organismo considerado seguro por la FDA
americana (GRAS: Generally Recognized as
Safe), y se posee una amplia experiencia en su
cultivo a escala industrial en fermentadores.
En los experimentos realizados, se
construyeron cinco fusiones génicas entre el
gen de la xilanasa A de Bacillus sp. BP-7 y el
gen de la proteína de pared Pir4 de
S. cerevisiae.
Pir4 es una proteína formada por dos
subunidades, S I hacia N-terminal y S II en
C-terminal, unidas entre sí a través del motivo
Pir (MP). Pir4 posee además en N-terminal un
péptido señal para su secreción en
S. cerevisiae.
Tras su síntesis en el retículo endoplasmático
de la levadura, la proteína Pir4 es procesada, a
nivel del aparato de Golgi, por la proteasa
Kex2 (Moukadiri et al., 1999), quedando
separada la subunidad I (con el péptido señal)
del resto de la proteína. A continuación, la
subunidad I es secretada al medio de cultivo;
mientras que el resto de Pir4 (MP + S II)
queda anclado a la pared celular gracias a que
contiene 4 cisteínas (1 a nivel del MP y 3 a
nivel de la S II) que permiten la formación de
puentes disulfuro para la unión a la pared
celular de la levadura.
Las distintas construcciones re1alizadas
(C1 - C5) contenían la secuencia codificante
de XynA desprovista de péptido señal
(aa 28 - aa 245) fusionada a posiciones
distintas de la secuencia codificante de Pir4
(Figura I.2.11):
– En la construcción C1 la secuencia
codificante de XynA fue insertada en la
región N-terminal de la subunidad I.
– En C2, XynA se insertó en la región
N-terminal de la subunidad II.
– En C3, XynA se insertó en la región
C-terminal de la subunidad II.
– En C4, la secuencia codificante de XynA
sustituyó gran parte de la secuencia
codificante de la subunidad II.
– En C5, la secuencia codificante de XynA
sustituyó prácticamente toda la secuencia
codificante de Pir4, excepto el péptido
señal.
Estas construcciones fueron expresadas con
éxito en S. cerevisiae BY4741 (cepa salvaje) y
S. cerevisiae mnn9 (cepa deficiente en
glicosilación); y se analizó su localización

celular mediante ensayos de actividad
xilanasa.
De las 5 construcciones (C1 - C5), cuatro de
ellas mostraron actividad xilanasa en placas
suplementadas con xilano-RBB, C1 - C4, lo
que indica el correcto plegamiento de la
xilanasa bacteriana en el huésped eucariota.
En el caso de la construcción C5, la falta de
actividad podría deberse a un incorrecto
plegamiento de la proteína a nivel del retículo
endoplasmático, tal como sucede con otras
proteínas de fusión con proteínas de pared de
la familia Pir en las que no se incluye la
subunidad II de la proteína Pir (Simonen et al.,
1994).
En el caso de la construcción C1, ésta dio
lugar a tenues halos de degradación en placas
suplementadas con xilano-RBB. Este hecho
podría deberse a que el procesamiento de la
proteína de fusión en el aparato de Golgi
separaría la subunidad I, con la actividad
xilanasa, de la subunidad II; lo cual podría
afectar al correcto plegamiento de la enzima,
tal como se ha mencionado anteriormente. El
fragmento procesado conteniendo la enzima
XynA y la subunidad I muy probablemente
sería secretado al medio de cultivo, en lugar de
quedar retenido en la pared celular.
Los productos génicos de las construcciones
C2 y C3, se detectaron mediante ensayos de
actividad xilanasa a nivel de la pared celular
de S. cerevisiae. Esto sería debido a que ambas
construcciones conservaban las 4 cisteínas
típicas de la familia Pir que permitirían la
151
formación de puentes disulfuro para la unión a
la pared celular.
En los clones de la cepa S. cerevisiae BY4741
con estas construcciones, C2 y C3, la mayoría
de la actividad xilanasa (100% y 96%
respectivamente) se detectó a nivel de pared;
mientras que en el caso de la cepa
S. cerevisiae mnn9, los clones con estas
construcciones, presentaron actividad xilanasa
tanto a nivel de pared celular como en los
sobrenadantes de cultivo, debido a que las
deficiencias en glicosilación de esta cepa
(Hernández et al., 1989) afectarían la unión de
Pir4 a la pared celular (Moukadiri et al.,
1999), y por tanto parte de la proteína de
fusión Pir4-XynA sufriría cierta secreción al
sobrenadante en lugar de quedar retenida en la
pared celular. Esta secreción parcial de
Pir4-XynA al medio de cultivo también
explicaría porque la actividad a nivel de pared
en la cepa mnn9 era menor que en la cepa
BY4741.
Por último, se observó que la proteína de
fusión Pir4-XynA resultante de la construcción
C4 era secretada de manera mayoritaria al
medio de cultivo (87 - 89% de la actividad
xilanasa total), tanto en los clones de la cepa
BY4741 como en los de la cepa mnn9. Esto
sería debido a que en esta construcción se
había eliminado la región de la subunidad II de
Pir4 que contiene 3 de las 4 cisteínas
conservadas, y por tanto la proteína resultante
no podría ser retenida en la pared celular. El
hecho de que esta proteína fuera secretada
también explicaría que los clones que
152

contenían la construcción C4 dieran mayores

halos de degradación del xilano-RBB en los 2. XYNB DE PAENIBACILLUS
ensayos de actividad en placa, al poder BARCINONENSIS
difundirse por el medio sólido.
2.1. Expresión en huéspedes
Los resultados de actividad y localización de
homólogos
las proteínas de fusión se vieron respaldadas
La xilanasa B (XynB) de Paenibacillus
por los resultados de western blot con
barcinonensis presenta unas propiedades, entre
anticuerpos anti-Pir4 obtenidos por el grupo
las que se encuentra su actividad
del Dr. Jesús Zueco en Valencia (Andrés et al.,
transxilosidasa (Blanco et al., 1996; Gallardo
2005).
et al., 2003), que confieren a esta enzima
especial interés por su potencial aplicación en
Se ha conseguido un sistema basado en la
la síntesis de nuevos xilósidos, de utilidad en
proteína Pir4 que permite direccionar xilanasas
la industria alimentaria o farmacéutica (Jiang
hacia la pared celular de levaduras o hacia el
et al., 2004). Con el fin de producir xilanasa B
medio de cultivo, para obtener enzimas
en elevadas cantidades, se decidió clonarla y
activas, bien inmovilizadas en la pared celular
sobreexpresarla en huéspedes homólogos. Se
o bien secretadas.
eligió para ello Bacillus subtilis, debido a que
Estos ensayos con S. cerevisiae facilitan el uso
es un sistema de expresión homólogo a
de XynA y otras xilanasas en la industria
Paenibacillus barcinonensis (del antiguo
panadera para obtener los efectos beneficiosos
género Bacillus). Bacillus subtilis es además
que se derivan de la aplicación de estas
un microorganismo GRAS, bien conocido,
enzimas en panificación (aumento del
fácilmente cultivable, y previamente utilizado
volumen y de la calidad de la miga, además de
con éxito para la producción industrial de
un efecto de antienranciamiento) (Linko et al.,
enzimas y otras proteínas (Harwood, 1992;
1997); con la ventaja añadida que conlleva el
Ferrari et al., 1993; Tremblay y Archibald,
hecho que sea la propia levadura utilizada para
1993; Wong, 1995). Además, presenta la
el esponjado de la masa panaria la que
ventaja añadida de tener la capacidad de
produzca xilanasas que queden expuestas al
secretar un gran número de proteínas al medio
medio y, por tanto, en contacto con las
extracelular, con lo que era de esperar que la
hemicelulosas sobre las que han de actuar.
xilanasa podría ser secretada al medio de
cultivo en lugar de permanecer dentro de las
células (como sucede en E. coli),

simplificándose así su purificación a escala
industrial (downstream-processing).
Concretamente, se eligieron las cepas Bacillus
subtilis MB216, por ser fácilmente
transformable (Lampen et al., 1986), y
Bacillus subtilis MW15, por ser una cepa
deficiente en proteasas, celulasas, lichenasas y
xilanasas (Wolf et al., 1995).
Se realizaron construcciones que contenían el
gen xynB en los vectores lanzadera
E. coli-Bacillus subtilis pBRSPO2 y pN5. Los
clones con la construcción pBRSPO2X20
(donde xynB está bajo el control del promotor
fuerte SPO2) mostraron una elevada
producción de actividad xilanasa; mientras que
los clones con la construcción pN5X20 (xynB
con su propio promotor) no presentaron
diferencias de actividad xilanasa con las
correspondientes cepas huésped.
La falta de expresión apreciable de XynB en
los clones con la construcción pN5X20 podría
deberse a que la potencial región promotora
del gen xynB (121 bp) clonada en pN5X20 no
era funcional en las cepas huéspedes
utilizadas, a pesar de su similitud con
A
secuencias reconocidas por la subunidad σ de
la ARN polimerasa de Bacillus subtilis y a
pesar también de que, por regla general, los
promotores de Bacillus y géneros afines dan
lugar a altos niveles de expresión en B. subtilis
(Sumitomo et al., 1995). Este hecho parece
indicar que dicha región de 121 bp en posición
5' del gen estructural xynB no es tampoco una
región promotora funcional en Paenibacillus
153
barcinonensis, y que falta alguna secuencia
importante en posición 5' necesaria para la
transcripción del gen xynB.
Por otra parte, los buenos niveles de expresión
obtenidos con el plásmido pRBSPO2X20 se
deberían al buen funcionamiento del promotor
SPO2 utilizado, tal como era de esperar en
base a publicaciones de otros autores (Schoner
et al., 1983; Overbeeke et al., 1990; Bolhuis et
al., 1999). Es probable que se puedan
conseguir niveles de expresión iguales e
incluso superiores a los obtenidos con el
promotor SPO2 utilizando otros promotores
fuertes en Bacillus subtilis, como por ejemplo
el promotor de la α−amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens (Palva et al., 1981;
Yamamoto et al., 2005) o el promotor SPO1
(Osburne y Craig, 1986).
De entre los clones con la misma construcción
pBRSPO2X20, el clon en la cepa B. subtilis
MW15 mostró más actividad que el clon
correspondiente en B. subtilis MB216, debido
seguramente a que la cepa B. subtilis MW15
es deficiente en 2 proteasas (la proteasa neutra
y la proteasa alcalina), mientras que la cepa
B. subtilis MB216 no lo es, de manera que en
el clon B. subtilis MW15/pRBSPO2X20 debe
haber menor proteólisis de la enzima
producida. La actividad xilanasa de este clon
proviene además exclusivamente de la
xilanasa recombinante, ya que la cepa huésped
Bacillus subtilis MW15 no presenta actividad
xilanasa basal detectable al tener
disrupcionado el gen xynA, que codifica la
154
xilanasa mayoritaria de la cepa. Por el
contrario, en el clon B. subtilis
MB216/pRBSPO2X20 parte de la actividad
xilanasa producida es actividad basal debida a
las xilanasas propias de la cepa huésped.
Continuando con el estudio de la expresión en
Bacillus subtilis MW15/pRBSPO2X20, se
observó que los niveles máximos de actividad
xilanasa se obtenían en fase estacionaria
avanzada, a los 3 - 4 días de cultivo, lo cual
concuerda con datos de producción de otras
enzimas en cepas de Bacillus (Blanco y Pastor,
1993; Kim y Pack, 1996). Estudios por
SDS-PAGE de los sobrenadantes de estos
cultivos mostraron que la xilanasa
representaba la banda proteica mayoritaria de
los mismos, hecho que confirma
sobreproducción de XynB en la
recombinante construida.
Los medios de cultivo que dieron lugar a
mayor producción de xilanasa fueron el caldo
nutritivo suplementado con paja de arroz o con
xilano de madera de abedul. En este último
medio se obtuvieron niveles de actividad en
los sobrenadantes unas 3 veces superiores a los
niveles de actividad intracelular del clon
original E. coli 5K/pX60.
El resto de medios de cultivo ensayados no
dieron lugar a estos niveles de producción,
siendo sorprendente la baja producción en los
medios MG, MG2 y, sobre todo, en el medio
BREC1, si se tiene en cuenta que contienen
altas concentraciones de amonio
minimizar la expresión de proteasas, y que
concretamente el medio BREC1 ha sido
descrito como un medio muy adecuado para la
sobreexpresión en Bacillus subtilis DB104,
cepa de la cual deriva la cepa MW15
(Overbeeke et al., 1990).
2.2. Localización celular
Cuando se comparó la actividad xilanasa en
los extractos celulares (intracelular) con la
actividad en los sobrenadantes (extracelular)
de cultivos de Bacillus subtilis
MW15/pRBSPO2X20 en fase estacionaria, se
observó que sorprendentemente la actividad
intracelular era más elevada de lo que se
B esperaría si la xilanasa B fuera secretada al
medio. Asimismo, estudios por SDS-PAGE
la confirmaron que la xilanasa B recombinante se
cepa encontraba en alta proporción tanto en los
sobrenadantes como en los extractos celulares
de cultivos en fase estacionaria.
Se comprobó que en cultivos jóvenes (hasta
24 h) la actividad xilanasa era
mayoritariamente intracelular, a medida que
los cultivos progresaban en la fase estacionaria
(1 - 2 días) la actividad empezaba a detectarse
en el medio extracelular; y sólo en cultivos en
fase estacionaria muy avanzada (3 - 4 días) los
niveles extracelulares de actividad xilanasa
superaban ligeramente a los intracelulares.
Puesto que la mayoría de enzimas
extracelulares de Bacillus son secretadas al
medio desde las primeras etapas de los
para cultivos (Jeong et al., 1998; Leloup et al.,
1999; Qureshy et al., 2000; Schallmey et al.,

2004); los resultados indicaban que la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis era
una enzima intracelular, que no se secretaba al
medio, y que, posiblemente, debido a lisis
celular se encontraría también en el
sobrenadante de cultivos viejos.
En base a estos datos, planteamos la hipótesis
según la cual la xilanasa B sería una enzima
intracelular cuya liberación al medio de cultivo
se podría producir de manera inespecífica por
lisis celular en determinadas condiciones. Ésto
se pudo constatar en la cepa recombinante
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, en la cual
los valores de lisis, medidos en función de la
actividad malato deshidrogenasa extracelular
respecto a la intracelular, presentaron
correlación con los valores de actividad de la
xilanasa B detectados en el compartimento
extracelular (Tabla III.2.7).
La realización de estudios de localización
celular en la cepa original Paenibacillus
barcinonensis resultó más compleja debido a
que dicha cepa, a diferencia del clon
B. subtilis MW15/pRBSPO2X20, posee un
sistema xilanolítico complejo con varias
enzimas con actividad xilanasa y xilosidasa
(Blanco y Pastor, 1993), de manera que no se
puede asociar directamente la actividad
xilanasa o xilosidasa de una fracción celular a
XynB.
Sin embargo, los análisis zimográficos en
geles nativos de los extractos celulares y los
sobrenadantes de cultivo permitieron obtener
155
una prueba empírica sólida del carácter
intracelular de XynB de Paenibacillus
barcinonensis. En este tipo de geles la banda
de actividad correspondiente a XynB se puede
diferenciar fácilmente del resto de xilanasas de
la cepa debido a su diferente movilidad
electroforética (Blanco et al., 1996). Esta
banda aparecía claramente en todas las
muestras analizadas de extractos celulares de
Paenibacillus barcinonensis, mientras que
sólo ocasionalmente se observaron bandas de
actividad correspondientes a XynB en algunos
sobrenadantes de Paenibacillus barcinonensis,
y siempre varios ordenes de magnitud más
tenues que las bandas de XynB observadas en
los correspondientes extractos celulares.
La posibilidad de que XynB fuera una enzima
secretada pero asociada a la pared bacteriana
fue descartada al comprobarse que sólo se
detectaba actividad xilanasa en el citoplasma,
no detectándose ésta en los restos de pared y
membranas celulares, tras analizar las
fracciones soluble y particulada de extractos
celulares de Paenibacillus barcinonensis.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
deducida del gen xynB de Paenibacillus
barcinonensis mostró la ausencia en la región
N-terminal de un péptido señal típico para
secreción en Bacillus y otros Gram + mediante
el sistema Sec (Sec pathway) o por el sistema
Tat (twin-arginine pathway). Un péptido señal
de este tipo debería de consistir en varios
aminoácidos con cargas positivas en el
extremo más N-terminal (dominio N), con la
156

presencia o no de secuencias KR o RR empíricamente mediante secuenciación del

(twin-arginine motif), seguidos de una zona de
aminoácidos hidrófobos (dominio H), y de
aminoácidos polares o cargados a continuación
y antes del lugar de corte por la peptidasa
señal (dominio C). Tampoco se identificó en
XynB la presencia de otros péptidos señales
menos frecuentes, como los utilizados por los
sistemas de secreción Com (dominio N +
dominio C + dominio H) o ABC (dominio N +
dominio C) (Tjalsma et al., 2004)
(Figura D.2.2).
La ausencia de péptido señal fue evidenciada
mediante análisis informáticos de la secuencia
proteica deducida mediante los programas
SignalP y PSort. También se verificó
extremo N-terminal de la xilanasa B presente
tanto en citoplasma como en sobrenadantes de
cultivo. En todos los casos se observó una
secuencia aminoacídica idéntica a la
N-terminal deducida a partir del gen xynB. Si
la xilanasa B fuera una proteína que se
secretara por cualquiera de los 4 sistemas de
secreción descritos en Bacillus y otros Gram +
(sistema Sec, sistema Tat, sistema Com y
sistema de transportadores ABC; Tjalsma et
al., 2004), deberían haberse observado
diferencias, debidas al procesamiento por parte
de cualquiera de los tipos de peptidasa señal
involucrados en secreción en este tipo de
bacterias.

Sistema de Peptidasas
secreción señal

Péptido señal de tipo Tw in-arginine

Tat N H C
++ K/RR ## AXA
+1
Tipo I
(SipS, SipT, SipU,
Péptido señal de tipo Sec SipV o SipW)
N H C
+++ G P AXA
+1
Sec
Péptido señal de lipoproteínas
N H C Tipo II
++ LXX C (LspA)
+1

Péptido señal de Pseudopilinas

Peptidasas de
Com N C H Pseudopilinas
KG F E (ComC)
+1

Péptido señal de Bacteriocinas y Feromonas

Transportadores
N C
ABC ABC
(SunT, AlbE/F)
+1

Figura D.2.2: Péptidos señal válidos en Bacillus y otros Gram +. Se representan los dominios N (con cargas
positivas, en rojo), C (con aminoácidos polares o cargados, en azul) y H (con aminoácidos hidrófobos, en
amarillo). (Tjalsma et al., 2004).

La ausencia de péptido señal impediría la
secreción de la xilanasa B al medio, ya que
todas las enzimas de Bacillus y géneros afines
(como Paenibacillus) descritas hasta la fecha
necesitan péptido señal para ser secretadas
(Nagarajan, 1993; Fu et al., 2007).
Estos hechos indicarían, en concordancia con
el resto de experimentos de localización, que
la xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis
es una enzima intracelular.
La localización intracelular de la xilanasa B
resulta sorprendente ya que las xilanasas,
como enzimas degradadoras de polímeros,
deben ser secretadas al medio para que puedan
actuar sobre el xilano (de elevado tamaño),
liberando xilooligómeros más pequeños que sí
pueden ser transportados al interior de la
célula para su completa degradación. Dado
que, tal como hemos demostrado, XynB no es
secretada al medio, su función natural no
puede ser la degradación del xilano, ya que en
condiciones normales no entraría en contacto
con él. Su función podría ser pues la
degradación de xilooligómeros cortos, de 3 o
más residuos de xilosa, resultantes de la
degradación extracelular del xilano por otras
xilanasas, una vez transportados al interior de
la célula. Esta posibilidad se vería respaldada
tanto por estudios previos que indican que
XynB presenta elevada actividad sobre estos
xilooligosacáridos (Blanco et al., 1996), como
por los datos de especificidad de sustrato
mostrados en el presente trabajo.
157
Cabe mencionar en este punto que, tal como se
comentó en la introducción, han sido descritas
xilanasas localizadas en el espacio
periplásmico de bacterias Gram negativas,
como es el caso de la bacteria del rumen
Prevotella bryantii, en la que
aproximadamente un 80% de la actividad
xilanasa se localiza en el periplasma (Miyazaki
et al., 1997); o de Cellvibrio mixtus, en la que
la xilanasa XylC presenta un péptido señal que
dirige su secreción al periplasma (Fontes et al.,
2000). Tal como sugieren estos autores, la
función de estas xilanasas periplásmicas no
sería tampoco la degradación del xilano, sino
que, muy posiblemente, sería la degradación
de aquellos xilooligosacáridos de menor
tamaño que pudieran atravesar la membrana
externa, al mismo tiempo que quedarían
protegidas en el periplasma de la acción de las
proteasas extracelulares.
Por último, los estudios de homología de
XynB mostraron que pertenecía a la familia 10
de glicosil hidrolasas, observándose un
elevado grado de homología con otras 6
xilanasas de esta familia. Nuestros estudios
han revelado que estas 6 xilanasas tienen una
serie de características comunes entre ellas y
con XynB, que las diferencian respecto al resto
de xilanasas de la familia. En concreto, estas
xilanasas no presentan evidencias de poseer
péptido señal (comprobado mediante análisis
informáticos de secuencia), y todas ellas
poseen 2 regiones de aminoácidos conservadas
no presentes en el resto de xilanasas de la
158
familia 10 (regiones A, AIE_YASL, y B,
RTDL__PT, flanqueando la región VI
conservada en las xilanasas de esta familia).
Además, XynB y estas 6 xilanasas homólogas
sin péptido señal son xilanasas de dominio
único, sin dominios extra de unión a sustratos
insolubles; y, en algunos casos, sus autores las
clasifican como xilanasas intracelulares o
como exoxilanasas (Usui et al., 1999; Shulami
et al., 1999), aunque en ningún caso se ha
mostrado evidencia experimental de la
localización intracelular de las mismas.
Al realizar estudios de agrupamiento en
dendrogramas, XynB y las 6 xilanasas
homólogas quedan agrupadas juntas, formando
un cluster, separadas del resto de miembros de
la familia 10 (Figura III.2.9).
Así, estaríamos ante un nuevo tipo de
xilanasas, dentro de la familia 10, con función
intracelular, posiblemente la degradación de
xilooligómeros pequeños, pero con actividad
claramente distinta a la de las xilosidasas al no
ser activas sobre xilobiosa. Este grupo de
enzimas constituirían pues un tipo intermedio
entre las xilanasas auténticas y las xilosidasas,
cuya función biológica en la degradación del
xilano todavía está por dilucidar
experimentalmente.
Para confirmar que realmente estas enzimas
forman un grupo aparte dentro de las xilanasas
de la familia 10, sería necesario un estudio
más amplio y detenido de las características
bioquímicas y estructurales de las xilanasas
homólogas a XynB, que agrupan junto a ella
en los árboles filogenéticos.
Sería necesaria también una caracterización
bioquímica exhaustiva de XynB, evaluando su
actividad sobre un amplio rango de
xilooligómeros y sustancias afines, con el fin
de dilucidar cuál es el sustrato natural de esta
enzima e identificar su función biológica.
Asimismo, el estudio detallado de la actividad
transglicosidasa de la xilanasa B, evidenciada
por la aparición de productos de mayor grado
de polimerización que los sustratos (Blanco et
al., 1996), podría ser de utilidad para
identificar la función biológica de XynB, ya
que muy posiblemente sea éste el mecanismo
responsable de que esta xilanasa presente la
inusualmente elevada actividad sobre
aril-xilósidos que se ha descrito en el trabajo.
La existencia de xilanasas intracelulares tanto
citosólicas como periplásmicas permitirían a
las bacterias que las poseen un rápido y eficaz
aprovechamiento de los productos resultantes
de la degradación del xilano extracelular,
llevada a cabo por xilanasas extracelulares
propias o de otras bacterias.
2.3. Relación estructura-función
Para profundizar en el conocimiento de la
xilanasa B de Paenibacillus barcinonensis, se
decidió realizar estudios de estructura-función.

A partir de los modelos de estructura
secundaria y terciaria de XynB,
posteriormente de la estructura tridimensional
determinada por cristalografía, se comprobó
que la estructura de la xilanasa era la típica
estructura de barril (α/β)8 o TIM-barrel de las
xilanasa de la familia 10. En esta estructura,
los aminoácidos catalíticos de la enzima (E241
y E134) quedarían muy próximos y hacia el
interior del barril en una hendidura de la
superficie de la proteína. Cabe recordar aquí
que en las xilanasas de la familia 10 el lugar de
unión al sustrato está en una hendidura poco
profunda (mientras que en las de la familia 11
el lugar de unión al sustrato está en un surco
más profundo), hecho que permite a las
xilanasas de esta familia ser menos estrictas en
cuanto al sustrato, mostrando una mayor
versatilidad catalítica que las xilanasas de la
familia 11 (Biely et al., 1997). En el caso de
XynB esta mayor laxitud respecto al sustrato
puede observarse en el análisis de su
especificidad de sustrato del capítulo III de
Resultados (Tabla III.2.1), ya que además de
actividad sobre diferentes xilanos (tanto de
maderas duras como de gramíneas) y la
elevada actividad sobre aril-xilósidos, la
xilanasa B presenta actividad significativa
sobre aril-glucósidos (pNPCel2 - pNPCel5),
característica particular de las xilanasas de la
familia 10 que sirve para diferenciarlas de las
de la familia 11 (Biely et al., 1997).
La estructura obtenida por cristalografía reveló
con detalle la hendidura catalítica, en la que se
159
distinguen 4 subsitios de unión al sustrato
y claramente definidos (subsitios -2, -1, +1 y
+2), y sugiere la existencia de 3 subsitios
adicionales (-3, +3 y +4) (Figura IV.2.9). La
presencia del elevado número de subsitios de
unión al sustrato es coherente con la capacidad
de la xilanasa B de hidrolizar oligosacáridos
de 3, 4 o más residuos de xilosa, y con su
ausencia de actividad frente a xilobiosa.
Además de los dos residuos de glutámico
catalíticos a nivel del subsitio -1, es importante
la presencia de otros residuos aromáticos
(W299, Y179 y F303) que ayudarían a
posicionar correctamente el sustrato en la
orientación correcta para la hidrólisis del
enlace glucosídico (Leggio et al., 2000);
asimismo estos residuos aromáticos, y en
especial el triptófano 299 en el subsitio -1,
actuarían como impedimento estérico para el
correcto posicionamiento de un anillo de
glucosa (con un CH2OH en lugar de un H
respecto a la xilosa) a nivel del subsitio -1, lo
cual explicaría la baja actividad (<1% de la
actividad máxima) de esta enzima sobre las
celulosas ensayadas (carboximetil celulosa y
Avicel).
También es importante resaltar la presencia de
una cavidad a nivel del subsitio +2, la cual
permitiría acomodar sustituyentes laterales en
el O2 de la xilosa posicionada en este subsitio,
como por ejemplo metil glucurónico (Pell et
al., 2004), lo que se ve corroborado por la
actividad de la xilanasa B sobre sustratos
como el glucuronoxilano.
160

Con el fin de profundizar en los estudios de la de puentes de hidrógeno que mantienen la

relación estructura-función, se decidió recurrir estructura necesaria para que las enzimas
a la ingeniería de proteínas, ya que se ha realicen su función concreta, obteniéndose
demostrado como una tecnología útil para como resultado enzimas inactivas (Hwang y
resolver cuestiones relativas a la estructura y la Warshel, 1988; Yano et al., 1998).
función de las proteínas, además de para Sin embargo, cuando se obtuvieron
obtener nuevas estructuras proteicas que estén posteriormente los resultados de cristalografía,
mejor preparadas para una utilización se observó que el bucle L7 (aminoácidos
industrial específica (Arrizubieta y Polaina, S245 - T260), que contiene la región
2000). conservada B y está afectado por las
En concreto, para estudiar la posible delecciones introducidas mediante
funcionalidad de la región conservada B mutagénesis dirigida, es esencial para
(RTDL__PT), distintiva del grupo de xilanasas determinar la conformación del centro activo
sin péptido señal y situada en uno de los de la xilanasa B, ya que los residuos R248,
bucles (o loops) exteriores de la estructura de H249 y E250 situados en dicho bucle son los
XynB, se decidió recurrir a una estrategia de principales responsables de la especificidad de
mutagénesis dirigida para obtener proteínas los subsitios +2 y +3 (Figura IV.2.9). Así, las
mutantes derivadas de ésta en las que dicha alteraciones debidas a las delecciones
región estuviera deleccionada total o introducidas no sólo podían afectar a la
parcialmente. estructura básica de la enzima, como se creyó
A pesar de que se consiguieron diferentes en un primer momento, sino que además
clones con delecciones de 4, 8 y 13 alteraban de manera importante el centro
aminoácidos en esta región, ninguno de ellos activo de la enzima al acortar y desestructurar
mostró actividad xilanasa o sobre pNPX, el bucle L7.
hecho que indica que estas xilanasas truncadas
no son funcionales. En cualquier caso, la falta de mutantes
En un principio se creyó que ésto funcionales no permite dilucidar si la región B
probablemente era debido a que se había juega alguna función o no, más allá de su
alterado la estructura básica de la enzima, al aparente papel en el mantenimiento de la
reducirse la distancia entre la séptima hebra β estructura del bucle L7, para el correcto
y la séptima hélice α del barril (α/β)8. Este tipo plegamiento del centro activo de la enzima.
de resultado negativo es bastante frecuente a la
hora de intentar rediseñar enzimas, ya que, por
ejemplo, es muy fácil desbaratar con las
modificaciones introducidas la intrincada red
 161

2.4. Termoestabilidad S15L y M93V, fueron aisladas mediante PCR

divergente en un sólo paso y expresadas de
Para conocer mejor la xilanasa B de
manera individual, obteniéndose de esta
Paenibacillus barcinonensis así como para
manera 4 xilanasas mutantes que fueron
mejorar sus cualidades para una posible
purificadas y caracterizadas en cuanto a
aplicación en la industria, se realizaron
termoestabilidad. Todas las xilanasas mutantes
experimentos de ingeniería de proteínas
presentaron una termoestabilidad superior a la
enfocados a modificar su termorresistencia.
xilanasa salvaje, tanto a 45 como a 50 ºC;
Debido a los problemas encontrados en la
destacando entre ellas las mutantes M93V y
obtención de resultados mediante mutagénesis
S15L, que presentaron a 50 ºC una vida media
dirigida y a los pocos conocimientos que
entre 3 y 4 veces superior a la de la enzima
disponíamos sobre la relación entre la
salvaje.
estructura y la función de XynB, se decidió
recurrir a la denominada “evolución dirigida”
Con el fin de mejorar el incremento de
(Hancock et al., 2006). Esta tecnología se basa
termoestabilidad que producían las mutaciones
en la generación aleatoria de una gran
de manera individual, se decidió combinarlas
variabilidad de copias mutantes del gen entre
creando 2 xilanasas dobles mutantes: una que
las que seleccionar a continuación aquellas que
contenía las 2 mejores mutaciones, M93V y
dan lugar a enzimas con las características
S15L, y otra que contenía las mutaciones
deseadas (López-Camacho y Polaina, 1993;
E137D y D323N.
Yano et al., 1998); en nuestro caso xilanasas
La xilanasa doble mutante E137D/D323N no
con una mayor termorresistencia.
mostró grandes diferencias de termoestabilidad
Un paso crítico en la estrategia de evolución
respecto a la enzima salvaje; mientras que la
dirigida es el procedimiento para generar las
xilanasa doble mutante S15L/M93V presentó
copias mutagenizadas. Se decidió utilizar la
un incremento notable en la termoestabilidad,
técnica de DNA shuffling, con o sin una etapa
siendo su vida media a 50 ºC 20 veces superior
previa de PCR mutagénica, ya que es una
a la de la xilanasa B salvaje y 2 veces superior
técnica que ha dado muy buenos resultados en
a la suma de las vidas medias de las mutantes
aproximaciones de este tipo (Stemmer, 1994;
simples S15L y M93V. Se constató pues un
López-Camacho et al., 1996; Sanz-Aparicio et
efecto sinérgico de estas 2 mutaciones sobre la
al., 1998; Arrizubieta y Polaina, 2000).
termoestabilidad de la xilanasa B. Diferentes
Mediante esta metodología se consiguió
estudios previos muestran también como la
obtener 3 clones mutantes termoestables, que
combinación de mutaciones puntuales que
contenían un total de 4 mutaciones en la
afectan positivamente la misma propiedad de
secuencia aminoacídica de XynB. Las 4
una proteína produce una enorme mejora de
mutaciones identificadas, E137D, D323N,
162

dicha propiedad, bien debido a un efecto

aditivo o a un efecto sinérgico (cooperativo,
como es nuestro caso) de las mutaciones
(Zhang et al., 1995; Kawamura et al., 1998;
Akanuma et al., 1999; Arrizubieta y Polaina,
2000).

Para inferir las posibles modificaciones

estructurales que determinaban los residuos
mutagenizados y como éstas podrían afectar
positivamente a la termoestabilidad de la
enzima XynB, se localizó la posición de las
mutaciones estudiadas sobre la estructura
tridimensional obtenida por cristalografía de la
xilanasa B.
Se observó que todas las mutaciones
caracterizadas quedaban en regiones
plegamiento superficial, bastante alejadas del
centro activo (Figura IV.2.21). La única de las
mutaciones que presentaba cierta proximidad
al centro activo era la mutación E137D,
cercana a nivel de estructura primaria al
aminoácido catalítico E134. Sin embargo, en
la representación de la superficie de la
proteína, se puede constatar como
aminoácido en esta posición no interviene en
el surco catalítico de la enzima (Figura D.2.3);
además del hecho de que se trata de un cambio
conservativo (glutámico por aspártico, ambos
aminoácidos ácidos) y por tanto suponemos
que no son de esperar grandes alteraciones de
cargas o en los enlaces salinos de esta región
cercana al centro activo.
También cabe remarcar que todas
mutaciones se sitúan en bucles (S15L y
Figura D.2.3: Localización sobre la superficie
tridimensional de XynB de los aminoácidos
catalíticos E241 y E134 (azul) en el surco
catalítico, y del glutámico mutagenizado E137D
(púrpura). Se aprecia claramente como este
aminoácido no forma parte del surco catalítico.
E137D) o en la frontera entre estructuras en
hélice α y bucles (M93V y D323N), lo cual es
consistente con el hecho de que los bucles son
las regiones de los barriles (α/β)8 con una
de mayor variabilidad en secuencia y donde más
cambios aminoacídicos pueden darse sin que
se produzca un cambio deletéreo en la enzima
(Sanz-Aparicio et al., 1998).
Al estudiar con más detalle las regiones (el
entorno) en que se encuentran las dos mejores
mutaciones, S15L y M93V, se observa como,
el en el caso de la mutación S15L, la serina en
posición 15 de la proteína salvaje está
estabilizada por 3 puentes de hidrógeno con
otros residuos polares de su entorno (Y12, N14
y R282). Su sustitución por leucina en las
mutantes imposibilita dos de estos puentes de
hidrógeno: los que se establecían con Y12 y
con R282 (Figura D.2.4).
Sin embargo, la leucina en las xilanasas
las mutantes puede establecer interacciones
hidrofóbicas con los anillos aromáticos de
 163

temperaturas cuando está situada en regiones

superficiales, hecho que llevaría a la
R282 N14
inactivación irreversible de la enzima (Estell
S15 et al., 1985; Glazer y Nikaido, 1995;
Arrizubieta y Polaina, 2000; Koc y Gladyshev
Y12
2007). Por el contrario estas modificaciones
F16
químicas no podrían darse sobre la valina de
las mutantes M93V, de manera que la

S15L
15L

R282
N14

L15 M93
F94

Y12
P90
F16
W92

Figura D.2.4: Entorno del residuo en posición 15

de XynB. Se muestra tanto la enzima original
M93V
93V
donde es una serina la que ocupa esta posición
(arriba, modelo obtenido por cristalografía), como
el resultado de sustituir dicha serina por leucina
(abajo, modelo obtenido por manipulación
informática). En ambos casos se marcan los
puentes de hidrógeno en línea discontinua de color
verde.

aminoácidos de su entorno, Y12 y F16,

V93
F94
permitiendo un plegamiento más compacto en
P90
esta zona (Akanuma et al., 1999).
W92

En el caso de la mutación M93V, la situación

es diferente. Aquí no se pierden puentes de
hidrógeno al cambiar la metionina en posición
93 por valina (Figura D.2.5).
Sin embargo, se ha descrito para otras enzimas
que la metionina es químicamente lábil y
propensa a la oxidación o desaminación a altas
Figura D.2.5: Entorno de la metionina en posición
93 en la proteína salvaje (arriba, modelo obtenido
por cristalografía), y entorno resultante al sustituir
dicha metionina por valina (abajo, modelo
obtenido por manipulación informática). En ambos
casos se muestra el único puente de hidrógeno de
la región en línea discontinua de color verde.
164
sustitución de metionina por valina permitiría
una mayor estabilidad de la xilanasa frente a la
temperatura. Además, esta sustitución podría
mejorar el empaquetamiento de esta región
debido a las mejores interacciones
hidrofóbicas con los aminoácidos del entorno,
W92 y F99, que puede establecer la valina al
presentar ésta una cadena lateral ramificada
(Arrizubieta y Polaina, 2000; Wu et al., 2007).
Para comprobar si estas modificaciones
aminoacídicas producían algún tipo de cambio
en la estructura secundaria respecto a la de la
xilanasa B salvaje, se hicieron análisis de
dicroísmo circular.
En los resultados obtenidos no se observaron
variaciones significativas alrededor de los
220 nm que permitieran inferir posibles
diferencias en la estructura secundaria (en el
grado de α-helipticidad o de contenido en
conformación hélice α) (Hurlbert y Preston,
2001). Asimismo, las ligeras diferencias en la
desviación de la luz encontradas en la zona de
230 nm entre la xilanasa B salvaje y la doble
mutante (Figura IV.2.22), serían debidas a
cambios puntuales causados por la
reorganización de los residuos aromáticos en
el entorno de los aminoácidos mutados.
En cualquier caso, tal como ha sido descrito
previamente (Akanuma et al., 1999), son
posibles aumentos en la termorresistencia
mediante pequeños cambios aminoacídicos sin
que ello conlleve cambios aparentes en la
estructura básica de las proteínas.
A partir de los resultados de los estudios
cinéticos que se realizaron con las xilanasas
mutantes, se observa que a pesar de las
importantes diferencias en cuanto a
termoestabilidad de estas proteínas, la
constante de Michaelis (KM) de éstas no
presenta grandes diferencias respecto a la KM
de la xilanasa B salvaje; aunque sí que se
aprecia una ligera reducción de esta constante
en el caso de las enzimas mutantes más
termorresistentes, especialmente en la doble
mutante S15L/M93V, lo que indicaría un
pequeño aumento de la afinidad (1/KM) de
estas mutantes por el sustrato.
Sin embargo, la constante catalítica (KCAT) aun
siendo muy similar entre todas las xilanasas
mutantes, resulta ser muy superior (alrededor
de un orden de magnitud) a la KCAT de la
xilanasa B salvaje. Esto significa que a pesar
de que no se ha modificado de manera
apreciable la afinidad en las mutantes, sí que
ha aumentado la cantidad de moléculas de
sustrato que una molécula de enzima mutante
puede convertir en producto por unidad de
tiempo.
Cabe destacar el caso de la doble mutante
XynB E137D/D323N, cuya termoestabilidad
es muy similar a la de la xilanasa B salvaje,
pero que, a pesar de tener la KM más parecida a
la de la enzima salvaje, presenta los valores de
KCAT más elevados. Esto es debido a su alta
VMáx en relación a la baja concentración de
enzima utilizada.
Resultados en el mismo sentido que para la
KCAT se obtuvieron al calcular la eficacia

catalítica (KCAT/KM): todas las xilanasas
mutantes presentan valores similares de
eficiencia catalítica, que son a su vez muy
superiores a la eficiencia catalítica de la
xilanasa B salvaje.
Se han conseguido pues no sólo aumentos en
la termoestabilidad de algunas de las xilanasas
mutantes, sino también aumentos en la
eficiencia catalítica.
Cambios aminoacídicos similares, que no
afectan a residuos de la hendidura catalítica
pero que sin embargo producen cambios en la
capacidad catalítica de una enzima, han sido
previamente descritos (Oue et al., 1999;
Shimotohno et al., 2001); y pueden resultar de
gran utilidad para el diseño de estrategias de
mutagénesis dirigida orientadas a modificar la
funcionalidad de la enzimas, debido a la
demostrada importancia funcional que tienen
también los residuos que no forman parte del
centro activo.
Actualmente se está llevando a cabo la
cristalización de la doble mutante S15L/M93V
para comprobar las hipótesis de mejora de
plegamiento propuestas. Asimismo, con la
estructura de la doble mutante obtendremos un
mayor conocimiento de XynB, que podría ser
utilizado para mejorar su potencial
biotecnológico.
165
3. APLICACIÓN DE LAS XILANASAS
ESTUDIADAS EN EL BLANQUEO DE LA
PASTA DE PAPEL
En el anexo I del presente trabajo se recogen
los resultados obtenidos de la aplicación de las
xilanasas YnfF y XynA de Bacillus sp. BP-7, y
XynB de Paenibacillus barcinonensis, en
estudios de blanqueo de pasta de papel.
Los resultados papeleros mostrados ponen de
manifiesto la diferente efectividad de las
xilanasas microbianas en el blanqueo de pastas
de papel (Elegir et al., 1995; Vicuña et al.,
1995; Clarke et al., 1997). Así, mientras XynB
no produjo mejoras apreciables, la aplicación
de YnfF y sobre todo de XynA permitieron
obtener mejoras notables en la blancura del
papel.
Es de destacar que la xilanasa más eficiente,
XynA, pertenece a la familia 11, a la cual
también pertenecen la mayoría de las xilanasas
utilizadas a nivel industrial para el blanqueo
del papel.
Es también importante mencionar los buenos
resultados de la xilanasa YnfF en la
potenciación del blanqueo. Esta enzima
pertenece a la familia 5 de glicosil hidrolasas,
de la que no se han descrito ensayos papeleros
hasta el momento. Sin embargo, tal como se ha
descrito en este trabajo, se trata de una
xilanasa que únicamente presenta actividad
sobre xilanos desprovistos de arabinosa, lo que
puede resultar de importancia para el blanqueo
de pastas de maderas duras, como la de
166

eucalipto, que es la materia prima más

importante en la industria papelera española.

Actualmente se están llevando a cabo nuevos

ensayos para cuantificar la efectividad
potenciadora del blanqueo de XynA e YnfF en
nuevas secuencias ECF (elemental chlorine
free) y en secuencias TCF (total chlorine free).
Estos ensayos también pretenden determinar la
contribución de estas enzimas a la disminución
de la dosis de blanqueantes químicos
necesarios (especialmente derivados clorados)
y evaluar así la reducción en la generación de
AOX, altamente contaminantes.
En este sentido, sería también de interés la
utilización de la xilanasa doble mutante
XynB S15L/M93V en ensayos papeleros, para
comprobar si su aplicación a las pastas
papeleras a temperaturas más altas y durante
más tiempo, gracias a su aumentada
termoestabilidad, permite mejorar los
resultados obtenidos hasta el momento con la
xilanasa B salvaje.
CONCLUSIONES

1.- Se han clonado e identificado 3 enzimas
degradadoras de xilano de la cepa
Bacillus sp. BP-7: XynA, YnfF y XynD.
2.- La xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7
presenta máxima actividad sobre xilano de
madera de haya. Es una enzima homóloga
a las xilanasas del subgrupo de pI alcalino
y bajo peso molecular de la familia 11.
3.- Los resultados del análisis de uso de
codón en XynA de Bacillus sp. BP-7
sugieren que la enzima, altamente
conservada en especies del género
Bacillus, posiblemente ha sido adquirida
por transferencia horizontal de genes entre
especies relacionadas de dicho género.
4.- Se ha conseguido diseñar un sistema
basado en la proteína Pir4 de
Saccharomyces cerevisiae para la
expresión y direccionamiento de la
xilanasa XynA de Bacillus sp. BP-7 a la
pared celular de levaduras o al medio de
extracelular, como primer paso hacia su
posible utilización biotecnológica en la
industria alimentaria.
5.- La xilanasa YnfF de Bacillus sp. BP-7 es
una de las pocas xilanasas descritas hasta
el momento en la familia 5 de glicosil
hidrolasas. YnfF presenta actividad sobre
xilanos con ramificaciones de ácido
metil glucurónico pero es inactiva sobre
xilanos con ramificaciones de arabinosa.
6.- La enzima XynD de Bacillus sp. BP-7
presenta alta homología con enzimas con
actividad xilanasa y arabinofuranosidasa
169
que se encuentran clasificadas en la
familia 43 de glicosil hidrolasas.
7.- La enzima XynB de Paenibacillus
barcinonensis es una xilanasa de la
familia 10 con elevada actividad sobre
xilanos y sobre aril-xilósidos.
8.- Se ha clonado y expresado la xilanasa
XynB de Paenibacillus barcinonensis en
cepas de Bacillus subtilis. La máxima
producción se ha obtenido con la cepa
recombinante B. subtilis
MW15/pRBSPO2X20, que contiene el
gen xynB bajo el control del promotor
SPO2.
9.- Los estudios de localización celular
indican que XynB de Paenibacillus
barcinonensis es un xilanasa intracelular.
Su detección en sobrenadantes de cultivos
viejos es debida a lisis celular y no a
auténtica secreción.
10.- La xilanasa XynB de Paenibacillus
barcinonensis junto con otras 6 xilanasas
altamente homólogas de la familia 10
forman un nuevo subgrupo de xilanasas
dentro de dicha familia. Las características
comunes de estas xilanasas son la
ausencia de péptido señal, y la presencia
de 2 secuencias conservadas, regiones A y
B, no presentes en el resto de xilanasas de
la familia 10.
11.- La estructura tridimensional de la
xilanasa B de Paenibacillus
barcinonensis, determinada por métodos
cristalográficos, es un barril (α/β)8, como
170

en el resto de las xilanasas de la familia 15.- La aplicación en el blanqueo de pastas de

10. La hendidura catalítica muestra 4 papel de las xilanasas YnfF y XynA de
subsitios de unión al sustrato claramente Bacillus sp. BP-7 permite obtener mejoras
definidos, y sugiere la existencia de 3 notables en la blancura del papel.
subsitios adicionales. Es importante la
presencia de una cavidad a nivel del
subsitio +2, que permitiría acomodar
sustituyentes laterales como ácido
metil glucurónico. También es de gran
importancia el bucle L7, que contiene la
región conservada B, para determinar la
conformación del centro activo de la
xilanasa.

12.- Mediante evolución dirigida se han

obtenido 4 mutantes termoestables de
XynB de Paenibacillus barcinonensis,
cada una de ellas con una de las siguientes
sustituciones: E137D, D323N, S15L y
M93V. Las variantes con las mutaciones
S15L y M93V presentan una vida media
claramente superior a la xilanasa salvaje.

13.- La combinación de las 2 mutaciones más

efectivas (S15L y M93V) en un doble
mutante S15L/M93V origina una xilanasa
con una vida media a 50 ºC incrementada
más de 20 veces respecto a la enzima
salvaje; hacho que se debería a un efecto
sinérgico de las mutaciones introducidas.

14.- Además de los aumentos en la

termoestabilidad de las xilanasas mutantes
se han conseguido también aumentos en la
eficiencia catalítica (KCAT/KM) de estas
enzimas.
BIBLIOGRAFÍA
 173

A Andrés, I., Gallardo, O., Parascandola, P.,

Javier Pastor, F.I. y Zueco, J. (2005) Use of
the cell wall protein Pir4 as a fusion partner
Ahuja, S.K., Ferreira, G.M. y Moreira, A.R.
for the expression of Bacillus sp. BP-7
(2004) Utilization of enzymes for
xylanase A in Saccharomyces cerevisiae.
environmental applications. Critical Reviews
Biotechnology and Bioengineering 89 (6):
in Biotechnology 24 (2-3): 125-154.
690-697.

Akanuma, S., Yamagishi, A., Tanaka, N. y

Arias, M.E., Arenas, M., Rodriguez, J.,
Oshima, T. (1999) Further improvement of the
Soliveri, J., Ball, A.S. y Hernandez, M. (2003)
thermal stability of a partially stabilized
Kraft Pulp Biobleaching and Mediated
Bacillus subtilis 3-isopropylmalate
Oxidation of a Nonphenolic Substrate by
dehydrogenase variant by random and site-
Laccase from Streptomyces cyaneus CECT
directed mutagenesis. European Journal of
3335. Applied and Environmental
Biochemistry / FEBS 260 (2): 499-504.
Microbiology 69 (4): 1953-1958.

Alonso, J.C. y Tailor, R.H. (1987) Initiation of

Arrizubieta, M.J. y Polaina, J. (2000)
plasmid pC194 replication and its control in
Increased thermal resistance and modification
Bacillus subtilis. Molecular and General
of the catalytic properties of a beta-
Genetics 210 (3):476-484.
glucosidase by random mutagenesis and in
vitro recombination. The Journal of Biological
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A.,
Chemistry 275 (37): 28843-28848.
Zhang, J., Zhang, Z., Miller W. y Lipman, D.J.
(1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a
new generation of protein database B
searchprograms. Nucleic Acids Research
25:3389-3402. Baba, T., Shinke, R. y Nanmori, T. (1994)
Identification and characterization of
Andrés, I. (2003) Inmovilización de ligandos, clustered genes for thermostable xylan-
enzimas y antígenos recombinantes en la degrading enzymes, β-xylosidase and
pared celular de Saccharomyces cerevisiae xylanase, of Bacillus stearothermophilus 21.
mediante técnicas de ingeniería genética. Applied and Enviromental Microbiology 60
Tesis Doctoral. Director Zueco, J. (7): 2252-2258.
Departamento de Microbiología y Ecologia,
Facultad de Farmacia, Universidad de Bairoch, A. y Apweiler, R. (2000) The SWISS-
Valencia. PROT protein sequence database and its
174

supplement TrEMBL in 2000. Nucleic Acids Applied Microbiology and Biotechnology 56

Research 28: 45-48. (3-4): 326-338.

Bajpai, P. (2004) Biological bleaching of Beychok, S. (1966) Circular dichroism of

chemical pulps. Critical Reviews in biological macromolecules. Science 154
Biotechnology 24 (1): 1-58. (754): 1288-1299.

Bayer, E.A., Shoham, Y. y Lamed, R. (2000) Biely, P. (1985). Microbial xylanolytic

Cellulose-decomposing prokaryotes and their systems. Trends in Biotechnology 3: 286-290.
enzyme system. En The Prokaryotes: An
Evolving Electronic Resource for the Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M. y
Microbiological Comunity, 3rd edn. Dworkin, Kluepfel, D. (1997) Endo-β-1,4-xylanase
M., Falcow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.H., families: differences in catalytic properties.
y Stackbrandt, E., eds. Springer, New York. Journal of Biotechnology 57 (1-3): 151-166.

Bayer, E.A., Belaich, J., Shoham, Y., y
Lamed, R. (2004) The cellulosomes:
multienzyme machines for degradation of
plant cell wall polysaccharides. Annual
Review of Microbiology 58: 521-54.
Bedford, M.R. y Classen, H.L. (1992)
Reduction of intestinal viscosity through
manipulation of dietary rye and pentosanase
concentration is effected through changes in
the carbohydrate composition of the intestinal
aqueous phase and results in improved growth
rate and food conversion efficiency of broiler
chicks. The Journal of Nutrition 122 (3): 560-
569.
Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L. y
Hoondal, G.S. (2001) Microbial xylanases and
their industrial applications: a review.
Biely, P., Mislovičová, D., Toman, R. (1998)
Remazol Brilliant Blue-Xylan: a soluble
chromogenic substrate for xylanase. Methods
in Enzymology 160: 536-541.
Bhat, M.K. (2000) Cellulases and related
enzymes in biotechnology. Biotechnology
Advances 18 (5): 355-383.
Black, G.W., Hazlewood, G.P., Millward-
Sadler, S.J., Laurie, J.I. y Gilbert, H.J. (1995)
A modular xylanase containing a novel non-
catalytic xylan-specific binding domain. The
Biochemical Journal 307: 191-195.
Blanco, A. y Pastor, F.I.J. (1993)
Characterization of cellulase-free xylanases
from the newly isolated Bacillus sp. Strain
BP-23. Canadian Journal of Microbiology 39:
1162-1166.

Blanco, A., Vidal, T., Colom, J.F. y Pastor,
F.I.J. (1995) Purification and Properties of
Xylanase A from Alkali-Tolerant Bacillus sp.
Strain BP-23. Applied and Environmental
Microbiology 61 (12): 4468-4470.
Blanco, A., Diaz, P., Martínez, J., López, O.,
Soler, C. y Pastor, F.I.J. (1996) Cloning of a
Bacillus sp. BP-23 gene encoding a xylanase
with high activity against aryl xylosides.
FEMS Microbiology Letters 137: 285-290.
Blanco, A., Díaz, P., Zueco, J., Parascandola,
P. y Javier Pastor, F.I. (1999) A multidomain
xylanase from a Bacillus sp. with a region
homologous to thermostabilizing domains of
thermophilic enzymes. Microbiology 145 (8):
2163-2170.
Bolhuis, A., Tjalsma, H., Smith, H.E., De
Jong, A. Meima, R., Venema, G., Bron, S. y
Van Dijl, J.M. (1999) Evaluation of
bottlenecks in the late stages of protein
secretion in Bacillus subtilis. Applied and
Environmental Microbiology 65: 2934-2941.
Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J.,
Betlach, M.C., Heyneker, H.L. y Boyer, H.W.
(1977) Construction and characterization of
new cloning vehicles. II. A multipurpose
cloning system. Gene 2 (2): 95-113.
Bolivar, F. y Backman, K. (1979) Plasmids of
Escherichia coli as cloning vectors. Methods
in Enzymology 68: 245-67.
175
Boraston, A.B., Bolam, D.N., Gilbert, H.J. y
Davies, G.J. (2004) Carbohydrate-binding
modules: fine-tuning polysaccharide
recognition. The Biochemical Journal 382:
769-781.
Bourbonnais, R., Paice, M.G., Freiermuth, B.,
Bodie, E. y Borneman, S. (1997) Reactivities
of Various Mediators and Laccases with Kraft
Pulp and Lignin Model Compounds. Applied
and Environmental Microbiology 63 (12):
4627-4632.
Bru, C., Courcelle, E., Carrere, S., Beausse,
Y., Dalmar, S. y Kahn, D. (2005) The ProDom
database of protein domain families: more
emphasis on 3D. Nucleic Acids Research 33
(suppl_1): D212-215.
Buchert, J., Bergnor, E., Lindblad, G., Viikari,
L. y Ek, M. (1997) Significance of xylan and
glucomannan in the brightness reversion of
kraft pulps. TAPPI Journal 80 (6): 165–171.
Bulheller, B.M., Rodger, A. y Hirst, J.D.
(2007) Circular and linear dichroism of
proteins. Physical Chemistry Chemical
Physics 9 (17): 2020-2035.
Bullock, W.O., Fernández, J.M. y Short, J.M.
(1987) XL1-Blue: A high efficiency plasmid
transforming recA Escherichia coli strain with
beta-galactosidase selection. Biotechniques 5:
376-377.
176

C Cho, S.G. y Choi, Y.J. (1999) Catabolite

repression of the xylanase gene (xynA)
expression in Bacillus stearothermophilus no.
Clarke, J.H., Davidson, K., Gilbert, H.J.,
236 and B. subtilis. Bioscience,
Fontes, C.M.G.A. y Hazlewood, G.P. (1996) A
Biotechnology, and Biochemistry 63 (12):
modular xylanase from mesophilic
2053-2058.
Cellulomonas fimi contains the same
cellulose-binding and thermostabilizing
Chothia, C. y Lesk, A.M. (1986) The relation
domains as xylanases from thermophilic
between the divergence of sequence and
bacteria. FEMS Microbiology Letters 139 (1):
structure in proteins. The EMBO Journal 5
27-35.
(4): 823-826.

Clarke, J.H., Rixon, J.E., Ciruela, A., Gilbert,

Christov, L., Biely, P., Kalogeris, E.,
H.J. y Hazlewood, G.P. (1997) Family-10 and
Christakopoulos, P., Prior, B.A. y Bhat, M.K.
Family-11 xylanases differ in their capacity to
(2000) Effects of purified endo-[beta]-1,4-
enhance the bleachability of hardwood and
xylanases of family 10 and 11 and acetyl xylan
softwood paper pulps. Applied Microbiology
esterases on eucalypt sulfite dissolving pulp.
and Biotechnology 48(2): 177-183.
Journal of Biotechnology, 83 (3): 231-244.

Chanda, S.K., Hirst, E.L., Jones, J.K.N. y

Cohen, S.N. y Chang, S. (1979) High
Percival, E.G.V. (1950) The constitution of
frequency transformation of Bacillus subtilis
xylan from esparto grass (Stipa tenacissima,
protoplasts by plasmid DNA. Molecular and
L.). Journal of the Chemical Society: 1289-
General Genetics 168: 111-115.
1297.

Cohen, S.N., Chang, A.C.Y. y L. Hsu. (1972)

Cheng, J., Randall, A.Z., Sweredoski, M.J. y
Nonchromosomal antibiotic resistance in
Baldi, P. (2005) SCRATCH: a protein
bacteria: Genetic transformation in
structure and structural feature prediction
Escherichia coli by R-factor DNA. Biochemica
server. Nucleic Acids Research 33 (suppl_2):
et Biophysica Acta 69: 2110.
W72-76.

Collins, T., Gerday, C. y Feller, G. (2005)

Cho, S. y Choi, Y. (1995) Nucleotide sequence
Xylanases, xylanase families and
analysis of an endo- xylanase gene (xynA)
extremophilic xylanases. FEMS Microbiology
from Bacillus stearothermophilus. Journal of
Reviews 29 (1): 3-23.
Microbiology and Biotechnology 5:117-124.
 177

Coughlan, M.P. y Hazlewood, G.P. (1993). Debeche, T., Cummings, N., Connerton, I.,
β− 1,4-D-xylan-degrading enzyme systems: Debeire, P. y O'Donohue, M.J. (2000) Genetic
biochemistry, molecular biology and and biochemical characterization of a highly
applications. Biotechnology and Applied thermostable alpha-L-arabinofuranosidase
Biochemistry 17: 259-289. from Thermobacillus xylanilyticus. Applied
and Enviromental Microbiology 66 (4): 1734-
Coughlan, M.P., Tuohy, M.G., Filho, E.X.F., 1736.
Puls, J., Claeyssens, M., Vrsanská, M. y
Hughes, M.M. (1993) Enzymological aspects Dekker, R.F.H. (1989) Biodegradation of the
of microbial hemicellulases with emphasis on hetero-1,4-linked xylans. En Plant Cell Wall
fungal systems. En Hemicelluloses and Polymers. pp. 619-629. Lewis, N.G. y M.G.
hemicellulases. pp. 53-84. Coughlan M.P y Paice, eds. American Chemical Society,
Hazlewood G.P, eds. Portland Press, London Washington.
and Chapel Hill.
Delmer D.P. y Amor Y. (1995) Cellulose
Coutinho, P.M. y Henrissat, B. (1999) byosinthesis. Plant Cell 7 (7): 987-1000.
Carbohydrate-active enzymes: an integrated
database approach. En Recent Advances in De Vries, R.P., Visser, J. y De Graaff, L.H.
Carbohydrate Bioengineering. pp. 3-12. (1999) CreA modulates the XlnR-induced
Gilbert, H.J., Davies, G.S., Henrissat, B., y expression on xylose of Aspergillus niger
Svensson. B., eds. The Royal Society of genes involved in xylan degradation. Research
Chemistry, Cambridge. in Microbiology 150 (4): 281-285.

Cuff, J.A. y Barton, G.J. (2000) Application of De Vries, R.P., Kester, H.C.M., Poulsen, C.H.,
multiple sequence alignment profiles to Benen, J.A.E. y Visser, J. (2000) Synergy
improve protein secondary structure between enzymes from Aspergillus involved in
prediction. Proteins 40 (3): 502-511. the degradation of plant cell wall
polysaccharides. Carbohydrates Research 327:

D 401-410.

De Vries, R.P. y Visser, J. (2001) Aspergillus

Davies, G. y Henrissat, B. (1995) Structures
enzymes involved in degradation of plant cell
and mechanisms of glycosyl hydrolases.
wall polysaccharides. Microbiology and
Structure 3 (9): 853-859.
Molecular Biology Reviews 65: 497-522.
178

E Bateman, A. (2006) Pfam: clans, web tools

and services. Nucleic Acids Research 34
(suppl_1): D247-D251
Eda, S., Ohnishi, A. y Katõ, K. (1976) Xylan
isolaed from the stalk of Nicotiana tabacum.
Fontes, C.M., Gilbert, H.J., Hazlewood, G.P.,
Agricultural and Biological Chemistry 40:
Clarke, J.H., Prates, J.A., McKie, V.A., Nagy
359-364.
T., Fernandes, T.H. y Ferreira, L.M. (2000) A
novel Cellvibrio mixtus family 10 xylanase
Elegir, G., Sykes, M. y Jeffries, T.W. (1995)
that is both intracellular and expressed under
Differential and synergistic action of
non-inducing conditions. Microbiology 146:
Streptomyces endoxylanases in prebleaching
1959-1967.
of kraft pulps. Enzyme and Microbial
Technology 17 (10): 954-959.
Fry, S.C. (2001) The Growing Plant Cell
Wall: Chemical and Metabolic Analysis. The
Estell, D., Graycar, T. y Wells, J. (1985)
Blackburn Press.
Engineering an enzyme by site-directed
mutagenesis to be resistant to chemical
Fu, L.L., Xu, Z.R., Li, W.F., Shuai, J.B., Lu,
oxidation. The Journal of Biological
P. y Hu, C.X. (2007). Protein secretion
Chemistry, 260 (11): 6518-6521.
pathways in Bacillus subtilis: Implication for
optimization of heterologous protein secretion.
F
Biotechnology Advances 25 (1): 1-12.

Ferrari, E., Jarnagin, A.S. y Schmidt, B.F.

Fujimoto, Z., Kuno, A., Kaneko, S., Yoshida,
(1993) Commercial production of
S., Kobayashi, H., Kusakabe, I. y Mizuno, H.
extracellular enzymes. En Bacillus subtilis and
(2000) Crystal structure of Streptomyces
other Gram-positive bacteria. Biochemistry,
olivaceoviridis E-86 β-xylanase containing
physiology and molecular genetics. pp. 917-
xylan-binding domain. Journal of Molecular
937. Sonenshein, A.L., Hoch, J.A. y Losick,
Biology 300(3): 575-585.
R., eds. American Society for Microbiology,
Washington.
Fukumura, M., Sakka, K., Shimada, K. y
Ohmiya, K. (1995) Nucleotide sequence of the
Finn, R.D., Mistry, J., Schuster-Bockler, B.,
Clostridium stercorarium xynB gene encoding
Griffiths-Jones, S., Hollich, V., Lassmann, T.,
an extremely thermostable xylanase, and
Moxon, S., Marshall, M., Khanna, A., Durbin,
characterization of the translated product.
R., Eddy, S.R., Sonnhammer, E.L.L. y Alex
 179

Bioscience, Biotechnology and Biochemistry substrate. Applied and Environmental

59 (1): 40-46. Microbiology 61 (12): 4403-4408.

Fukusaki, E., Panbangred, W., Shinmyo, A. y Gibbs, M.D., Reeves, R.A., Farrington, G.K.,
Okada, H. (1984) The complete nucleotide Anderson, P., Williams, D.P. y Bergquist, P.L.
sequence of the xylanase gene (xynA) of (2000) Multidomain and multifunctional
Bacillus pumilus. FEBS Letters 171:197-201 glycosyl hydrolases from the extreme
thermophile Caldicellulosiruptor isolate
G Tok7B.1. Current Microbiology 40 (5): 333-
340.

Ganga, M.A., Pinaga, F., Valles, S., Ramon,

Gilkes, N.R., Henrissat, B., Kilburn, D.G.,
D. y Querol, A. (1999) Aroma improving in
Miller Jr., R.C y. Warren, R.A.J. (1991)
microvinification processes by the use of a
recombinant wine yeast strain expressing the Domains in microbial β-1,4-glicanases:
Aspergillus nidulans xlnA gene. International sequence conservation, function and enzyme

Journal of Food Microbiology 47 (3): 171-178. families. Microbiological Reviews 55: 303-
315.

Garcia-Vallvé, S., Palau, J. y Romeu, A.

(1999) Horizontal gene transfer in glycosyl Glazer, A. y Nikaido, H. (1995) Genetic

hydrolases inferred from codon usage in Engineering of Subtilisin. En Microbial

Escherichia coli and Bacillus subtilis. Biotechnology: Fundamentals of Applied

Molecular Biology and Evolution 16 (9): Microbiology. pp 257-259. W.H. Freeman

1125-1134. And Company, New York.

Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Godessart, N., Muñoa, F. J., Regue, M. y

Ivanyi, I., Appel, R.D. y Bairoch, A. (2003) Juárez, A. (1988) Chromosomal mutations

ExPASy: the proteomics server for in-depth that increase the production of a plasmid-

protein knowledge and analysis. Nucleic Acids encoded haemolysin in Escherichia coli.

Research 31 (13): 3784-3788. Journal of General Microbiology 134 (10):

2779-87.

Gibbs, M.D., Reeves, R.A. y Bergquist, P.L.

(1995) Cloning, sequencing, and expression of González Arzola, K., Polvillo, O., Arias, M.E.,

a xylanase gene from the extreme thermophile Perestelo, F., Carnicero, A., González-Vila,

Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 and F.J., y Falcón, M.A. (2006) Early attack and

activity of the enzyme on fiber-bound subsequent changes produced in an industrial

180
lignin by a fungal laccase and a laccase-
mediator system: an analytical approach.
Applied Microbiology and Biotechnology 73
(1), 141-150.
Goodwin, T.W. y Mercer, E.I. (1990) The
plant cell wall. En Introduction to Plant
Biochemistry. pp. 55-91. Goodwin, T.W. y
Mercer, E.I., eds. Pergamon Press, Oxford.
Gosalbes, M.J., Perez-Gonzalez,
Gonzalez, R. y Navarro, A. (1991) Two beta-
glycanase genes are clustered in Bacillus
polymyxa: molecular cloning, expression, and
sequence analysis of genes encoding a
xylanase and an endo-beta-(1,3)-(1,4)-
glucanase. Journal of Bacteriology 173 (23):
7705-7710.
H glycosyl hydrolases based on amino acid
Hanahan, D. (1983) Studies on transformation
of Escherichia coli with plasmids. Journal of
Molecular Biology 166 (4): 557-580.
Hames, B.D. y Rickwood, D. (1981) Gel
electrophoresis of proteins. A practical
approach. IRL Press Ltd, Oxford.
Hancock, S.M., Vaughan, M.D. y Withers,
S.G. (2006). Engineering of glycosidases and
glycosyltransferases. Current Opinion
Chemical Biology 10 (5): 509-519.
Harwood, C.R., Coxon R.D. y Hancock, I.C.
(1990). The Bacillus cell envelope and
secretion. Molecular biological methods for
Bacillus. pp. 327-390. Harwood, C.R. y
Cutting, S.M., ed. John & Sons Ltd, England.
Harwood, C.R. (1992) Bacillus subtilis and its
relatives: molecular biological and industrial
workhorses. Trends in Biotechnology 10 (7):
247-256.
J.A.,
Hatti-Kaul, R., Mattiasson, B., Martinez, A.,
Delgado, O. y Mamo, G. (2006) Cloning,
Sequence Analysis, and Expression of a Gene
Encoding an Endoxylanase From Bacillus
halodurans S7. Molecular Biotechnology 33
(2): 149-160.
Henrissat, B. (1991). A classification of
sequence similarities. The Biochemical
Journal 280: 309-316.
Henrissat, B. y Bairoch, A. (1996) Updating
the sequence-based classification of glycosyl
hydrolases. The Biochemical Journal 316:
695-696.
Heredia, A., Jiménez, A. y Guillén, R. (1995).
Composition of plant cell wall. Zeitschrift für
Lebensmittel-untersuchung und-Forschung
200: 24-31.
in
Hernández, L.M., Ballou, L., Alvarado, E.,
Gillece-Castro, B., Burlingame, A.L. y Ballou,
 181

C.E. (1989) A new Saccharomyces cerevisiae and Environmental Microbiology 60 (3): 763-
mnn mutant N-linked oligosaccharide 770.
structure. The Journal of Biological Chemistry
264 (20): 11849-11856. Irwin, D., Shin, D., Zhang, S., Barr, B.K.,
Sakon, J., Karplus, P.A. y Willson, D.B.
Hoch, J.A. (1991) Genetic analysis in Bacillus (1998) Roles of the Catalytic Domain and Two
subtilis. Methods in Enzymology 204: 305-320 Cellulose Binding Domains of
Thermomonospora fusca E4 in Cellulose
Honda, Y. y Kitaoka, M. (2004) A Family 8 Hydrolysis. Journal of Bacteriology 180 (7):
Glycoside Hydrolase from Bacillus halodurans 1709-1714.
C-125 (BH2105) Is a Reducing End Xylose-
releasing Exo-oligoxylanase. The Journal of J
Biological Chemistry 279 (53): 55097-55103.

Jiang, Z., Zhu, Y., Li, L., Yu, X., Kusakabe, I.,
Hoondal, G.S., Tiwari, R.P., Tewari, R.,
Kitaoka, M. y Hayashi, K. (2004)
Dahiya, N. y Beg, Q.K. (2002) Microbial
Transglycosylation reaction of xylanase B
alkaline pectinases and their industrial
from the hyperthermophilic Thermotoga
applications: a review. Applied Microbiology
maritima with the ability of synthesis of
and Biotechnology 59 (4): 409-418.
tertiary alkyl β-xylobiosides and xylosides.
Journal of Biotechnology 114 (1-2): 125-134.
Hurlbert, J.C. y Preston, J.F. (2001)
Functional characterization of a novel
Jiang, Z., Dang, W., Yan, Q., Zhai, Q., Li, L. y
xylanase from a corn strain of Erwinia
Kusakabe, I. (2006) Subunit composition of a
chrysanthemi. Journal of Bacteriology 183 (6):
large xylanolytic complex (xylanosome) from
2093-2100.
Streptomyces olivaceoviridis E-86. Journal of
Biotechnology 126 (3): 304-312.
Hwang, J. y Warshel, A. (1988) Why ion pair
reversal by protein engineering is unlikely to
Jeffries, T.W. (1983) Utilization of xylose by
succeed. Nature 334 (6179): 270-272.
bacteria, yeasts, and fungi. En Pentoses and
Lignin. pp 1-32 Advances in biochemical
I Engineering/Biotechnology 27. Springer,
Berlin.
Irwin, D., Jung, E.D. y Wilson, D.B. (1994)
Characterization and sequence of a Jeong, K.J., Park, I.Y., Kim, M.S. y Kim, S.C.
Thermomonospora fusca xylanase. Applied (1998) High-level expression of an
182
endoxylanase gene from Bacillus sp. in
Bacillus subtilis DB104 for the production of
xylobiose from xylan. Applied Microbiology
and Biotechnology 50 (1): 113-118.
Joseleau, J.P., Comtat, J. y Ruel, K. (1992).
Chemical structure of xylans and their
interaction in the plant cell wall. En Xylans
and xylanases. pp. 1-15. Visser, J., Beldman,
G., Kusters-van Someren, M.A. y A.G.J.
Voragen, eds. Elsevier Science Publishers,
Amsterdam.
Ju-Hyun, Y., Park, Y.S., Yum, D.Y., Kim,
J.M., Kong, I.S. y Bai, D.H. (1993) Nucleotide
sequence and analysis of a xylanase gene
(xynS) from alkali-tolerant Bacillus sp. YA-14
and comparison with other xylanases. Journal
of Microbiology and Biotechnology 3: 139-
145.
K Overproduction
Kaji, A. (1984) L-arabinosidases. Advances in
Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 42:
383-394.
Kataeva, I.A., Seidel, R.D., Shah, A., West,
L.T., Li, X. y Ljungdahl, L.G. (2002) The
fibronectin type 3-like repeat from the
Clostridium thermocellum cellobiohydrolase
CbhA promotes hydrolysis of cellulose by
modifying its surface. Applied and
Environmental Microbiology 68(9): 4292-
4300.
Kawamura, S., Abe, Y., Ueda, T., Masumoto,
K., Imoto, T., Yamasaki, N. y Kimura, M.
(1998) Investigation of the Structural Basis for
Thermostability of DNA-binding Protein HU
from Bacillus stearothermophilus. The Journal
of Biological Chemistry 273 (32): 19982-
19987.
Khandke, K.M., Vithayathil, P.J. y Murthy,
S.K. (1989) Purification and characterization
of an α-D-glucuronidase from a thermophilic
fungus, Thermoascus aurantiacus. Archives of
Biochemistry and Biophysics 274: 511-517.
Keen, N.T., Boyd, C. y Henrissat, B. (1996)
Cloning and characterization of a xylanase
gene from corn strains of Erwinia
chrysanthemi. Molecular Plant Microbe
Interactions 9 (7): 651-657.
Kim, J.H. y Pack, M.Y. (1993)
of extracellular
endoglucanase by genetically engingeered
Bacillus subtilis. Biotechnology Letters 15 (2):
133-138.
Koc, A. y Gladyshev, V.N. (2007) Methionine
sulfoxide reduction and the aging process.
Annals of the New York Academy of
Sciences, 1100, 383-386.
Kolek, J. y Kozinka, V. (1992) Physiology of
the Plant Root System. Kolek, J. y Kozinka,
V., eds. Springer.
 183

Kolenova, K., Vrsanska, M. y Biely, P. (2005) American Society for Microbiology,

Purification and characterization of two minor Washington, D.C.
endo-[beta]-1,4-xylanases of Schizophyllum
commune. Enzyme and Microbial Technology Larson, S., Day, J., BarbadelaRosa, A., Keen,
36 (7): 903-910. N. y McPherson, A. (2003) First
Crystallographic Structure of a Xylanase from
Kubata, B.K., Takamizawa, K., Kawai, K., Glycoside Hydrolase Family 5: Implications
Suzuki, T. y Horitsu, H.. (1995). Xylanase IV, for Catalysis. Biochemistry 42 (28): 8411-
an Exoxylanase of Aeromonas caviae ME-1 8422.
Wich Produces Xylotetraose as the Only Low-
Molecular-Weight. Applied and Lee, J. (1997) Biological conversion of
Environmental Microbiology 61: 1666-1668. lignocellulosic biomass to ethanol. Journal of
Biotechnology 56 (1): 1-24.
Kulkarni, N., Shendye, A. y Rao, M. (1999)
Molecular and biotechnological aspects of Lee, Y.E. y Zeikus, J.G. (1993) Genetics
xylanases. FEMS Microbiology Reviews 23 organization, sequence and biochemical
(4): 411-456. characterization of recombinant β-xylosidase
from Thermoanaerobacterium saccharolyticum
Kunst, F., Ogasawara, N., Moszer, I., <146 strain B6A-RI. Journal of General
autores más>, Yoshikawa, H. y Danchin, A. Microbiology 139: 1235-1243.
(1997) The complete genome sequence of the
Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Leggio, L.L., Jenkins, J., Harris, G.W. y
Nature 390: 249-256. Pickersgill, R.W. (2000) X-ray
crystallographic study of xylopentaose binding
L to Pseudomonas fluorescens xylanase A.
Proteins 41 (3): 362-373.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural

proteins during the assembly of the head of Leloup, L., Le Saux, J., Petit-Glatron, M.F. y

bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Chambert, R. (1999) Kinetics of the secretion
of Bacillus subtilis levanase overproduced

Lampen, J.O., Pastor, F.I.J. y Hussain, M. during the exponential phase of growth.

(1986) Processing of secreted proteins and the Microbiology 145: 613-619.

signal peptidases of Bacilli. En Microbiology.

pp. 279-282. Leive, L., Bon-ventre, P.F., Lerouxel, O., Cavalier, D.M., Liepman, A.H. y

Morello, J.A., Silver, S.D. y Wu, H.C., eds. Keegstra, K. (2006) Biosynthesis of plant cell
184
wall polysaccharides - a complex process.
Current Opinion in Plant Biology 9 (6): 621-
630.
Lieberman, R.L., Wustman, B.A., Huertas, P.,
Powe, A.C., Pine, C.W., Khanna,
Schlossmacher, M.G., Ringe, D. y Petsko,
G.A. (2007) Structure of acid β-glucosidase
with pharmacological chaperone provides
insight into Gaucher disease. Nature Chemical
Biology 3 (2): 101-107.
Linder, M. y Teeri, T.T. (1997) The roles and
function of cellulose-binding domains. Journal
of Biotechnology 57 (1-3): 15-28.
Lindner, C., Stülke, J. y Hecker, M. (1994)
Regulation of xylanolytic enzymes in Bacillus
subtilis. Microbiology 140: 753-757.
Linko, Y.Y., Javanainen, P. y Linko, S. (1997)
Biotechnology of bread baking. Trends in
Food Science and Technology 8: 339-344.
López, C., Blanco, A. y Javier, F.I.J. (1998)
Xylanase production by a new alkali-tolerant
isolate of Bacillus. Biotechnology Letters 20
(3): 243-246.
López-Camacho, C., y Polaina, J. (1993)
Random mutagenesis of a plasmid-borne
glycosidase gene and phenotypic selection of
mutants in Escherichia coli. Mutation
Research 301 (2): 73-77.
Lopez-Camacho, C., Salgado, J., Lequerica,
J.L., Madarro, A., Ballestar, E., Franco, L. y
Polaina, J. (1996) Amino acid substitutions
enhancing thermostability of Bacillus
polymyxa beta-glucosidase A. Biochemical
R., Journal 314 (Pt 3): 833-838.
Luthi, E., Love, D.R., McAnulty, J., Wallace,
C., Caughey, P.A., Saul, D. y Bergquist, P.L.
(1990) Cloning, sequence analysis, and
expression of genes encoding xylan-degrading
enzymes from the thermophile Caldocellum
saccharolyticum. Applied and Environmental
Microbiology 56: 1017-1024.
M
Maciag, I.E., Viret, J.F. y Alonso, J.C. (1988)
Replication and incompatibility properties of
plasmid pUB110 in Bacillus subtilis.
Molecular and General Genetics 212 (2): 232-
240.
MaCkenzie, C.R., Bilous, D., Schneider, H. y
Johnson, K.G. (1987). Induction of cellulolytic
and xylanolytic enzyme systems in
Streptomyces spp. Applied and Environmental
Microbiology 53: 2835-2839.
Markwalder, H.U. y Neukom, H. (1976)
Diferulic acid as a possible crosslink in
hemicelluloses from wheat germ.
Phytochemistry 15: 836-837.

Martínez, A.T., Speranza, M., Ruiz-Dueñas,
F.J., Ferreira, P., Camarero, S., Guillén, F.,
Martínez, M.J., Gutiérrez, A. y del Río, J.C.
(2005) Biodegradation of lignocellulosics:
microbial, chemical, and enzymatic aspects of
the fungal attack of lignin. International
Microbiology 8 (3): 195-204.
Miyazaki, K., Martin, J.C., Marinsek-Logar,
R. y Flint, H.J. (1997) Degradation and
Utilization of Xylans by the Rumen Anaerobe
Prevotella bryantii (formerly P. ruminicola
subsp. brevis) B14. Anaerobe 3 (6): 373-381.
Monfort, A., Blasco, A., Prieto, J. y Sanz, P.
(1996) Combined Expression of Aspergillus
nidulans Endoxylanase X24 and Aspergillus
oryzae (alpha)-Amylase in Industrial Baker's
Yeasts and Their Use in Bread Making.
Applied and Environmental Microbiology 62
(10): 3712-3715.
Montiel, M.D., Hernández, M., Rodríguez, J. y
Arias, M.E. (2002) Evaluation of an endo-
beta-mannanase produced by Streptomyces
ipomoea CECT 3341 for the biobleaching of
pine kraft pulps. Applied Microbiology and
Biotechnology 58 (1): 67-72.
Morris, D.D., Gibbs, M.D., Ford, M., Thomas,
J. y Bergquist, P.L. (1999) Family 10 and 11
xylanase genes from Caldicellulosiruptor sp.
strain Rt69B.1. Extremophiles 1999 3 (2):103-
111.
185
Moszer, I., Glaser, P. y Danchin, A. (1995)
SubtiList: a relational database for the
Bacillus subtilis genome. Microbiology
(Reading, England) 141 ( Pt 2): 261-268.
Moszer, I. (1998) The complete genome of
Bacillus subtilis: From sequence annotation to
data management and analysis. FEBS Letters
430: 28-36.
Moukadiri, I., Jaafar, L. y Zueco, J. (1999)
Identification of Two Mannoproteins Released
from Cell Walls of a Saccharomyces cerevisiae
mnn1 mnn9 Double Mutant by Reducing
Agents. Journal of Bacteriology 181 (16):
4741-4745.
N
Nagarajan, V. (1993) Protein secretion. En
Bacillus subtilis and other Gram-Positive
bacteria. Biochemistry, physiology and
molecular genetics. pp. 713-726. Hoch, J.A. y
Losick R., eds. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
Nakai, K. y Kanehisa, M. (1991) Expert
system for predicting protein localization sites
in gram-negative bacteria. Proteins 11 (2): 95-
110.
Nakai, K. y Kanehisa, M. (1992) A knowledge
base for predicting protein localization sites in
eukaryotic cells. Genomics 1992 14 (4): 897-
911.
186

Niall, H.D. (1973) Automated Edman Oue, S., Okamoto, A., Yano, T. y
degradation: the protein sequenator. Methods Kagamiyama, H. (1999) Redesigning the
in Enzymology 27: 942-1010. Substrate Specificity of an Enzyme by
Cumulative Effects of the Mutations of Non-
Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S. y von active Site Residues. The Journal of Biological
Heijne, G. (1997) Identification of prokaryotic Chemistry 274 (4): 2344-2349.
and eukaryotic signal peptides and prediction
of their cleavage sites. Protein Engineering 10 Overbeeke, N., Termorshuizen, G.H.M.,
(1): 1-6. Giuseppin, M.L.F., Underwood, D.R. y
Verrips C.T. (1990) Secretion of the α-
Nielsen, H., Brunak, S. Y Heijne, G. (1999) Glactosidase from Cyamopsis tetragonoloba
Machine learning approaches to the (Guar) by Bacillus subtilis. Applied and
prediction of signal peptides and other protein Environmental Microbiology 56 (5): 1429-
sorting signals. Protein Engineering 12: 3-9. 1434.

O P

Oakley, A.J., Heinrich, T., Thompson, C.A. y
Wilce, M.C.J. (2003) Characterization of a
family 11 xylanase from Bacillus subtillis
B230 used for paper bleaching.
Crystallographica. Section D, Biological
Crystallography 59 (4): 627-636.
Obst, M., Meding, E.R., Vogel, R.F. y
Hammes, W.P. (1995) Two genes encoding
the beta-galactosidase of Lactobacillus sake.
Microbiology 141: 3059-3066.
Osburne, M.S. y Craig R.J. (1986) Activity of
two strong promoters cloned into Bacillus
subtilis. Journal of General Microbiology 132:
565-568.
Packman, L.C. (1993) Protein chemical
methods for molecular biologists. Methods in
Molecular and Cellular Biology 4: 189-198.
Acta
Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M.,
Jurasek, L. Y Yaguchi, M. (1986) A xylanase
gene from Bacillus subtilis: nucleotide
sequence and comparation with B. pumilus
gene. Archives of Microbiology 144: 201-206.
Palva, I., Petterson, R.F., Kalkkinen, N.,
Lehtovaara, P., Sarvas, M., Södelund, H.,
Takkinen, K. y Kääriäinen L. (1981)
Nucleotide sequence of the promoter and the
NH2-terminal signal peptide region of the alfa-
amilase gene from Bacillus amyloliquefaciens.
Gene 15: 43-51.
 187

Page, R.D.M. (1996) TREEVIEW: An Pell, G., Szabo, L., Charnock, S.J., Xie, H.,
application to display phylogenetic trees on Gloster, T.M., Davies, G.J. y Gilbert, H.J.
personal computers. Computer Applications in (2004a) Structural and biochemical analysis
the Biosciences 12: 357-358. of Cellvibrio japonicus xylanase 10C: how
variation in substrate-binding cleft influences
Parajo, J.C., Dominguez, H. y Dominguez, J. the catalytic profile of family GH-10
(1998) Biotechnological production of xylitol. xylanases. The Journal of Biological
Part 1: Interest of xylitol and fundamentals of Chemistry 279 (12): 11777-11788.
its biosynthesis. Bioresource Technology 65
(3): 191-201. Pell, G., Taylor, E.J., Gloster, T.M.,
Turkenburg, J.P., Fontes, C.M.G.A., Ferreira,
Parajo, J.C., Dominguez, H. y Dominguez, J. L.M.A., Nagy, T., Clark, S.J., Davies, G.J. y
(1998) Biotechnological production of xylitol. Gilbert, H.J. (2004) The Mechanisms by
Part 2: Operation in culture media made with Which Family 10 Glycoside Hydrolases Bind
commercial sugars. Bioresource Technology Decorated Substrates. The Journal of
65 (3): 203-212. Biological Chemistry 279 (10): 9597-9605.

Pason, P., Kyu, K.L., y Ratanakhanokchai, K.
(2006). Paenibacillus curdlanolyticus Strain
B-6 Xylanolytic-Cellulolytic Enzyme System
That Degrades Insoluble Polysaccharides.
Applied and Environmental Microbiology 72
(4): 2483-2490.
Pastor, F.I.J., López, J.L., Díaz, P. y Blanco,
A. (1999) Expresión de la celulasa A de
Bacillus sp. BP-23 en cepas de Bacillus sin
fondo celulolítico. Congreso de la Sociedad
Española de Microbiología, Granada, 17-21 de
Septiembre, Resúmenes Volumen II: C 10-45.
Pearson, W.R. (1990) Rapid and sensitive
sequence comparison with FASTP and
FASTA. Methods in Enzymology 183: 63- 98.
Petit-Breuilh, X., Zaror, C. y Melo, R. (2004)
Hexenuronic acid removal from unbleached
krat eucalyptus pulp by peroxymonosulfuric.
Journal of the Chilean Chemical Society 49
(4): 355-360.
Polizeli, M.L.T.M., Rizzatti, A.C.S., Monti,
R., Terenzi, H.F., Jorge, J.A. y Amorim, D.S.
(2005) Xylanases from fungi: properties and
industrial applications. Applied Microbiology
and Biotechnology 67 (5): 577-591.
Proctor, M.R., Taylor, E.J., Nurizzo, D.,
Turkenburg, J.P., Lloyd, R.M., Vardakou, M.,
Davis, G.J. y Gilbert, H.J. (2005) Tailored
catalysts for plant cell-wall degradation:
Redesigning the exo/endo preference of
Cellvibrio japonicus arabinanase 43A.
188

Proceedings of the National Academy of Rye, C.S. y Withers, S.G. (2000) Glycosidase
Sciences of the United States of America 102 mechanisms. Current Opinion in Chemical
(8): 2697-2702. Biology 4(5): 573-580.

Puls, J., Schmidt, O. y Granzow, C. (1987) S

α− Glucuronidase in two microbial xylanolytic
systems. Enzyme and Microbial Technology 9:
83-88.
Q unique type of cellulase among Bacillales.
Qureshy, A.F., Khan, L.A. y Khanna, S.
(2000) Expression of Bacillus circulans Teri-
42 xylanase gene in Bacillus subtilis. Enzyme
and Microbial Technology 27: 227-233.
Sánchez, M.M., Pastor, F.I.J. y Diaz, P. (2003)
Exo-mode of action of cellobiohydrolase
Cel48C from Paenibacillus sp. BP-23. A
European Journal of Biochemistry 270 (13):
2913-2919.
Sánchez, M.M., Fritze, D., Blanco, A., Spröer,
C., Tindall, B.J., Schumann, P., Kroppenstedt,
R.M., Diaz, P. y Pastor, F.I.J. (2005)

R Paenibacillus barcinonensis sp. nov., a

xylanase-producing bacterium isolated from a
rice field in the Ebro River delta. International
Reilly, P.J. (1981). Xylanases structure and
Journal of Systematic and Evolutionary
function. Trends in the biology of fermentation
Microbiology 55: 935-939.
for fuels and chemicals. pp. 111-126.
Hollander, A., ed. Plenum Press, New York
Sabini, E., Wilson, K.S., Danielsen, S.,
and London.
Schülein, M. y Davies, G.J. (2001)
Oligosaccharide binding to family 11
Robles, J. y Doers, M. (1994) pGEM®-T
xylanases: both covalent intermediate and
Vector Systems troubleshooting guide.
mutant product complexes display (2,5)B
Promega Notes 45: 19-20.
conformations at the active centre. Acta
Crystallographica. Section D, Biological
Roncero, M.B., Torres, A.L., Colom, J.F. y
Crystallography 57 (9): 1344-1347.
Vidal, T. (2003) Effect of xylanase on ozone
bleaching kinetics and properties of
Saha, B.C. (2000). α-L-Arabinofuranosidases:
Eucalyptus kraft pulp. Journal of Chemical
biochemistry, molecular biology and
Technology & Biotechnology 78 (10): 1023-
application in biotechnology. Biotechnology
1031.
Advances 18: 403-423.

Sanz-Aparicio, J., Hermoso, J.A., Martínez-
Ripoll, M., González, B., López-Camacho, C.
y Polaina, J. (1998). Structural basis of
increased resistance to thermal denaturation
induced by single amino acid substitution in
the sequence of beta-glucosidase A from
Bacillus polymyxa. Proteins 33 (4): 567-676.
Saxena, I.M. y Brown, R.M. (2005) Cellulose
biosynthesis: current views and evolving
concepts. Annals of Botany 96: 9-21
Schäfer, T., Borchert, T.W., Nielsen, V.S.,
Skagerlind, P., Gibson, K., Wenger, K.,
Hatzack, F., Nilsson, L.D., Salmon, S.,
Pedersen, S., Heldt-Hansen, H.P., Poulsen,
P.B., Lund, H., Oxenbøll, K.M., Wu, G.F.,
Pedersen, H.H., Xu, H. (2007) Industrial
enzymes. En White Biotechnology. pp. 59-131.
Springer, Berlin / Heidelberg.
Schallmey, M., Singh, A. y Ward, O.P. (2004).
Developments in the use of Bacillus species
for industrial production. Canadian Journal of
Microbiology 50 (1): 1-17.
Schoner, R.G., Williams, D.M. y Lovett, P.S.
(1983) Enhaced expression of mouse
dihydrofolate reductase in Bacillus subtilis.
Gene 22: 47-57.
Shoham, Y., Lamed, R., y Bayer, E.A. (1999)
The cellulosome concept as an efficient
microbial strategy for the degradation of
189
insoluble polysaccharides. Trends in
Microbiology 7 (7): 275-281.
Shulami, S., Gat, O., Sonenshein, A.L. y
Shoham, Y. (1999) The glucuronic acid
utilization gene cluster from Bacillus
stearothermophilus T-6. Journal of
Bacteriology 181 (12): 3695-3704.
Schwede, T., Kopp, J., Guex, N. y Peitsch,
M.C. (2003) SWISS-MODEL: an automated
protein homology-modeling server. Nucleic
Acids Research 31 (13): 3381-3385.
Simonen, M., Jämsä, E. y Makarow, M. (1994)
The role of the carrier protein and disulfide
formation in the folding of beta-lactamase
fusion proteins in the endoplasmic reticulum
of yeast. The Journal of Biological Chemistry
269 (19): 13887-13892.
Sigoillot, C., Camarero, S., Vidal, T., Record,
E., Asther, M., Perez-Boada, M., Martínez,
M.J., Sigoillot, J., Asther, M., Colom, J.F. y
Martínez, A.T. (2005) Comparison of different
fungal enzymes for bleaching high-quality
paper pulps. Journal of Biotechnology 115 (4):
333-343.
Shimotohno, A., Oue, S., Yano, T., Kuramitsu,
S. y Kagamiyama, H. (2001) Demonstration of
the Importance and Usefulness of
Manipulating Non-Active-Site Residues in
Protein Design. Journal of Biochemistry
(Tokyo) 129 (6): 943-948.
190

Smith, C.J. (1993) Carbohydrate chemistry. methylglucuronoxylan utilization. Applied and

En Plant Biochemistry and Molecular Environmental Microbiology 72 (2): 1496-
Biology. pp. 74-111. Lea, P.J. y Leegood, 1506.
R.C., eds. John Wiley and Sons, Ltd,
Inglaterra. St. John, F.J., Rice, J.D. y Preston, J.F.
(2006b) Characterization of XynC from
Smith , H.L., Bron, S., van Hee, J. Y Venema, Bacillus subtilis subsp. subtilis Strain 168 and
G. (1987) Construction and use of signal Analysis of Its Role in Depolymerization of
sequence selection vectors in Escherichia coli Glucuronoxylan. Journal of Bacteriology 188
and Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology (24): 8617-8626.
169: 3321-3328.
Stemmer, W.P.C. (1994) Rapid evolution of a
Spiro R.G. (1966) The Nelson-Somogyi protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370
copper reduction method. Analysis of sugar (6488): 389-391.
found in glycoporteins. Methods in
Enzymology 8: 3-26. Studier, F. W. y Moffatt, B. A. (1986). Use of
bacteriophage T7 RNA polymerase to direct
Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G., selective high-level expression of cloned
Facette, M., Hamann, T., Milne, J., Osborne, genes. Journal of Molecular Biology 189 (1):
E., Paredez, A., Persson, S., Raab, T., 113-130.
Vorwerk, S. y Youngs, H. (2004) Toward a
Systems Approach to Understanding Plant Stülke, J. y Hillen, W. (2000) Regulation of
Cell Walls. Science 306: 2206-2211. carbon catabolism in bacillus species. Annual
Review of Microbiology 54 (1): 849-880.
Soriano, M. (2004) Análisis de sistemas
pectinolíticos bacterianos. Aislamiento y Sulzenbacher, G., Schülein, M. y Davies, G.J.
caracterización de las pectinasas PelA de (1997) Structure of the endoglucanase I from
Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de Bacillus Fusarium oxysporum: native, cellobiose, and
subtilis. Tesis Doctoral. Director Pastor, F.I.J. 3,4-epoxybutyl β-D-cellobioside-inhibited
Departamento de Microbiología, Facultad de forms, at 2.3 Å resolution. Biochemistry 36
Biología, Universitat de Barcelona. (19): 5902-5911.

St. John, F.J., Rice, J.D. y Preston, J.F. Sumitomo, N., Ozaki, K., Hitomi, J.,
(2006a) Paenibacillus sp. strain JDR-2 and Kawaminami, S., Kobayashi, T., Kawai, S. y
XynA1: a novel system for Ito, S. (1995) Application of the upstream
 191

region of a Bacillus endoglucanase gene to beta-1,4-xylanase from an alkalophilic

high-level expression of foreign genes in Bacillus strain (N137). Applied and
Bacillus subtilis. Bioscience, Biotechnology, Environmental Microbiology 61 (6): 2420-
and Biochemistry 59 (11): 2172-2175. 2424.

Sun, Y., y Cheng, J. (2002) Hydrolysis of Tajana, E., Fiechter, A. y Zimmermann, W.

lignocellulosic materials for ethanol
production: a review. Bioresource Technology
83 (1): 1-11.
Sunna, A., Gibbs, M.D. y Bergquist, P.L.
(2000) A novel thermostable multidomain 1,4-
beta-xylanase from Caldibacillus
cellulovorans and effect of its xylan-binding
domain on enzyme activity. Microbiology
146: 2947-2955.
Suurnäkki, A., Clark, T.A., Allison, R.W.,
Viikari, L. y Buchert, J. (1996) Xylanase- and
mannanase-aided ecf and tcf bleaching.
TAPPI Journal 79 (7): 111-117.
Suzuki, T., Ibata, K., Hatsu, M., Takamizawa,
K. y Kawai, K.(1997) Cloning and expression
of a 58-kDa xylanase VI gene (xynD) of
Aeromonas caviae ME-1 in Escherichia coli
which is not categorized as a family F or
family G xylanase. Journal of Fermentation
and Bioengineering 84: 86-89.
T quality analysis tools. Nucleic Acids Research
(1992) Purification and characterization of
two α-L-arabinofuranosidases from
Streptomyces diastaticus. Applied and
Environmental Microbiology 58 (5): 1447-
1450.
Tenkanen, M. y Poutanen, K. (1992).
Significance of esterases in the degradation of
xylans. En Xylans and xylanases. pp. 203-212.
Visser, J., Beldman, G., Kusters-van Someren,
M.A. y A.G.J. Voragen, eds. Elsevier Science
Publishers, Amsterdam.
Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J.
(1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment
through sequence weighting, positions-specific
gap penalties and weight matrix choice.
Nucleic Acids Research 22: 4673-4680.
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F.,
Jeanmougin, F. y Higgins, D.G. (1997) The
ClustalX windows interface: flexible strategies
for multiple sequence alignment aided by
24: 4876-4882.

Tabernero, C., Sánchez-Torres, J., Perez, P. y

Santamaria, R.I. (1995) Cloning and DNA
sequencing of xyaA, a gene encoding an endo-
192

Thomson, J.A. (1993) Molecular biology of Aeromonas caviae ME-1 that produces
xylan degradation. FEMS Microbiology exclusively xylobiose and xylotetraose from
Reviews 104: 65-82. xylan. Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry 63 (8): 1346-1352.
Timell, T.E. (1967) Recent progress in the
chemistry of wood hemicelluloses. Wood V
Science and Technology 1: 45-70.

Van Petegem, F., Collins, T., Meuwis, M.,

Tjalsma, H., Antelmann, H., Jongbloed, J.D.,
Gerday, C., Feller, G. y Van Beeumen, J.
Braun, P.G., Darmon, E., Dorenbos, R.,
(2003) The structure of a cold-adapted family
Dubois, J.Y., Westers, H., Zanen, G., Quax,
8 xylanase at 1.3 A resolution. Structural
W.J., Kuipers, O.P., Bron, S., Hecker, M. y
adaptations to cold and investgation of the
van Dijl, J.M. (2004) Proteomics of Protein
active site. The Journal of Biological
Secretion by Bacillus subtilis: Separating the
Chemistry 278 (9): 7531-7539.
"Secrets" of the Secretome. Microbiology and
Molecular Biology Reviews 68 (2): 207-233.
Vardakou, M., Flint, J., Christakopoulos, P.,
Lewis, R.J., Gilbert, H.J. y Murray, J.W.
Tomme, P., Boraston, A., McLean, B.,
(2005) A Family 10 Thermoascus aurantiacus
Kormos, J., Creagh, A.L., Sturch, K., Gilkes,
Xylanase Utilizes Arabinose Decorations of
N.R., Haynes, C.A., Warren, R.A. y Kilburn,
Xylan as Significant Substrate Specificity
D.G. (1998) Characterization and affinity
Determinants. Journal of Molecular Biology
applications of cellulose-binding domains.
352 (5): 1060-1067.
Journal of Chromatography. B, Biomedical
Sciences and Applications 715 (1): 283-296.
Vicuña, R., Oyarzún, E. y Osses, M. (1995)
Assessment of various commercial enzymes in
Tremblay, L. y Archibald, F. (1993)
the bleaching of radiata pine kraft pulps.
Production of a cloned xylanase in Bacillus
Journal of Biotechnology 40 (3): 163-168.
cereus and its performance in kraft pulp
prebleaching. Canadian Journal of
Viikari, L., Kantelinen, A., Sundquist, J. y
Microbiology 39 (9): 853-860.
Linko, M. (1994) Xylanases in bleaching:
from an idea to the industry. FEMS
U Microbiology Reviews 13: 335-350.

Usui, K., Ibata, K., Suzuki, T. y Kawai, K. Viikari, L., Tenkanen, M. y Suurnäkki, A.
(1999) XynX, a posible exo-xylanase of (2001) Biotechnology in the pulp and paper

industry. REHM, H. J. (ed.) Biotechnology.
Weinheim: Wiley-VCH, 10: 523-546.
Vrsanska, M., Kolenova, K., Puchart, V. y
Biely, P. (2007) Mode of action of glycoside
hydrolase family 5 glucuronoxylan
xylanohydrolase from Erwinia chrysanthemi.
FEBS Journal 274 (7): 1666-1677.
W Matthews, C.R. (2007) A Tightly Packed
Wakarchuk, W.W., Campbell, R.L., Sung,
W.L., Davoodi, J. y Yaguchi, M. (1994)
Mutational and crystallographic analyses of
the active site residues of the Bacillus
circulans xylanase. Protein Science 3 (3): 467-
475.
Williams, D.M., Schoner, R.G., Duvall, E.J.,
Preis, L.H. y Lovett, P.S. (1981b) Expression
of E. coli trp genes and the mouse
dihydrofolate reductase gene cloned in
Bacillus subtilis. Gene 16: 199-206.
Wolf, M., Geczi, A., Simon, O. y Borriss, R.
(1995) Genes encoding xylan and β-glucan
hydrolysin enzymes in Bacillus subtilis:
characterization, mapping and construction of
strains deficient in lichenase, cellulase an
xylanase. Microbiology 141: 281-290.
Wong, K.K.Y., Tan, L.U.L. y Saddler, J.N.
(1988) Multiplicity of β-1,4-xylanase in
193
microorganisms: Funtions and applications.
Microbiological Reviews 52: 305-317.
Wong, S. (1995) Advances in the use of
Bacillus subtilis for the expression and
secretion of heterologous proteins. Current
Opinion in Biotechnology 6 (5): 517-522.
Wu, Y., Vadrevu, R., Kathuria, S., Yang, X. y
Hydrophobic Cluster Directs the Formation of
an Off-pathway Sub-millisecond Folding
Intermediate in the α Subunit of Tryptophan
Synthase, a TIM Barrel Protein. Journal of
Molecular Biology 366 (5): 1624-1638.
Y
Yamamoto, T., Mukai, K., Maruta, K.,
Watanabe, H., Yamashita, H., Nishimoto, T.,
Kubota, M., Chaen, H. y Fukuda, S. (2005)
Hyper expression of kojibiose phosphorylase
gene and trehalose phosphorylase gene from
Thermoanaerobacter brockii ATCC35047 in
Bacillus subtilis and selaginose synthesis
utilizing two phosphorylases. Journal of
Bioscience and Bioengineering 100 (3): 343-
346.
Yang, R.C., MacKenzie, C.R. y Narang, S.A.
(1988) Nucleotide sequence of a Bacillus
circulans xylanase gene. Nucleic Acids
Research 16 (14B): 7187.
194

Yang, R.C., MacKenzie, C.R., Bilous, D. y

Narang, S.A. (1989) Identification of two
distinct Bacillus circulans xylanases by
molecular cloning of the genes and expression
in Escherichia coli. Applied and
Environmental Microbiology 55 (3): 568-572.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. y Messing, J.

(1985) Improved M13 phage cloning vectors
and host strains: nucleotide sequences of the
M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1):
103-119.

Yano, T., Oue, S. y Kagamiyama, H. (1998)

Directed evolution of an aspartate
aminotransferase with new substrate
specificities. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of
America 95 (10): 5511-5515.

Yip, V.L.Y. y Withers, S.G. (2004) Nature's

many mechanisms for the degradation of
oligosaccharides. Organic and Biomolecular
Chemistry 2(19): 2707-2713.

Yu, J.H., Park, Y.S., Yum, D.Y., Kim, J.M. y

Kong, I.S. (1993) Nucleotide Sequence and
Analysis of a Xylanase gene (xynS) from
Alkali-tolerant Bacillus sp. YA-14 and
Comparison with Other Xylanases. Journal of
Microbiology and Biotechnology 3 (3): 139-
145.
PUBLICACIONES
Los artículos publicados derivados del presente trabajo de investigación son:

Gallardo, O., Diaz, P. y Pastor, F.I. (2003) Characterization of a Paenibacillus

cell-associated xylanase with high activity on aryl-xylosides: a new subclass of family
10 xylanases. Applied Microbiology and Biotechnology 61 (3): 226-233.

Gallardo, O., Diaz, P. y Pastor, F.I. (2004) Cloning and characterization of xylanase A
from the strain Bacillus sp. BP-7: comparison with alkaline pI-low molecular weight
xylanases of family 11. Current Microbiology 48 (4): 276-279.

Andrés, I., Gallardo, O., Parascandola, P., Javier Pastor, F.I. y Zueco, J. (2005) Use of
the cell wall protein Pir4 as a fusion partner for the expression of Bacillus sp. BP-7
xylanase A in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering 89 (6):
690-697.

Gallardo, O., Diaz, P. y Pastor, F.I.J. (2007) Cloning and production of Xylanase B
from Paenibacillus barcinonensis in Bacillus subtilis hosts. Biocatalysis and
Biotransformation 25 (2): 157-162.
Appl Microbiol Biotechnol (2003) 61:226–233
DOI 10.1007/s00253-003-1239-1
ORIGINAL PAPER
O. Gallardo · P. Diaz · F. I. J. Pastor
Characterization of a Paenibacillus cell-associated xylanase
with high activity on aryl-xylosides: a new subclass
of family 10 xylanases
Received: 8 October 2002 / Revised: 13 December 2002 / Accepted: 16 December 2002 / Published online: 27 February 2003

Springer-Verlag 2003
Abstract The sequence of gene xynB encoding xylanase
B from Paenibacillus sp. BP-23 was determined. It
revealed an open reading frame of 999 nucleotides
encoding a protein of 38,561 Da. The deduced amino
acid sequence of xylanase B shows that the N-terminal
region of the enzyme lacks the features of a signal
peptide. When the xylan-degrading system of Paenibacil-
lus sp. BP-23 was analysed in zymograms, it revealed that
xylanase B was not secreted to the extracellular medium
but instead remained cell-associated, even in late station-
ary-phase cultures. When xynB was expressed in a
Bacillus subtilis secreting host, it also remained associ-
ated with the cells. Sequence homology analysis showed
that xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23 belongs to
family 10 glycosyl hydrolases, exhibiting a distinctive
high homology to six xylanases of this family. The
homologous enzymes were also found to be devoid of a
signal peptide and seem to constitute, together with
xylanase B, a separate group of enzymes. They all have
two conserved amino acid regions not found in the other
family 10 xylanases, and cluster in a separate group after
dendrogram analysis. We propose that these enzymes
constitute a new subclass of family 10 xylanases, that are
cell-associated, and that hydrolyse the xylooligosaccha-
rides resulting from extracellular xylan hydrolysis.
Xylanase B shows similar specific activity on aryl-
xylosides and xylans. This can be correlated to some, not
yet identified, trait of catalytic activity of the enzyme on
plant xylan.
O. Gallardo · P. Diaz · F. I. J. Pastor ())
Department of Microbiology, Faculty of Biology,
University of Barcelona,
Avinguda Diagonal 645, 08028 Barcelona, Spain
e-mail: fpastor@bio.ub.es
Tel.: +34-93-4034626
Fax: +34-93-4034629
Introduction
Biodegradation of xylan, an abundant plant polysaccha-
ride, is a complex process that requires the coordinated
action of several enzymes, among which xylanases (1,4-
b-d-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving internal
linkages on the b-1,4-xylose backbone, play a key role.
The complex chemical nature and heterogeneity of xylan
can account for the multiplicity of xylanases produced by
microoorganisms (Kulkarni et al. 1999). The activity of
different xylanases with subtle differences in substrate
specificity and mode of action should improve degrada-
tion of plant xylan in natural habitats. Based on amino
acid sequence homologies and hydrophobic cluster anal-
ysis, xylanases have been classified in two groups, family
10 and family 11 (Gilkes et al. 1991; Henrissat and
Bairoch 1996). However, xylanases homologous to family
5 b-glycanases have also been found (Keen et al. 1996).
Although xylanases show remarkable differences in
sequence, only minor differences in catalytic activity
between xylanases of the different families have been
reported (Biely et al. 1997). These differences have been
proposed to result from differences in the three-dimen-
sional structure of their catalytic domains, which show
greater conformational flexibility in family 10 enzymes
(Davies and Henrissat 1995). Several xylanases are
single-domain enzymes, while other xylanases have a
modular structure that, in addition to a catalytic domain,
contains one or more cellulose-binding domains (Tomme
et al. 1998). Recent identification of domains that
promote specific binding to xylan or other carbohydrates
has prompted the term "carbohydrate-binding module" to
group domains that mediate substrate binding (Charnock
et al. 2000).
Xylanases are secreted enzymes, released to the
extracellular medium to enable contact with and cleavage
of highly polymerized xylans. However, an intracellular
xylanase has recently been described in Cellvibrio mixtus
(Fontes et al. 2000). The enzyme is located in the
periplasm, where it is probably involved in the breakdown
of large xylooligosaccharides and protected from extra-

cellular proteases. A similar location of xylanase activity
has been reported in the rumen bacterium Prevotella
ruminicola (Miyazaki et al. 1997).
The strain Paenibacillus sp. BP-23, previously termed
Bacillus sp. BP-23, secretes into the extracellular media a
set of xylanases, several of which have been characterized
(Blanco and Pastor 1993; Blanco et al. 1995, 1999). In
this article we describe the characterization of xylanase B
from this strain, which has been cloned in Escherichia
coli (Blanco et al. 1996). Xylanase B does not exhibit a
signal peptide for its secretion outside the cytoplasm and
shows activity on both xylans and aryl-xylosides. The role
of the enzyme in plant xylan biodegradation is discussed.
Materials and methods
Bacterial strains and plasmids
Paenibacillus sp. strain BP-23 was grown as described previously
(Blanco and Pastor 1993). E. coli-pX20 and E. coli-pX60,
described previously (Blanco et al. 1996), are recombinant strains
containing xynB. Bacillus subtilis MW15 has been described
elsewhere (Wolf et al. 1995). Plasmid pRB473 is a shuttle vector
for E. coli and B. subtilis (Brckner 1992). The SPO2 promoter was
amplified by PCR from plasmid pPL608 (Schoner et al. 1983) and
inserted between XbaI and BamHI sites of plasmid pRB473
polylinker. The resultant plasmid was named pRBSPO. The
structural part of xynB was amplified by PCR from pX60, and
inserted between SacI and SmaI sites of pRBSPO, downstream of
the SPO2 promoter. The resultant plasmid was named pRB-
SPOX20.
Nucleic acid manipulations
Plasmid DNA was purified by the alkaline lysis procedure
(Sambrook et al. 1989) or by chromatography (QIAGEN-tip 100
MidiPrep, Promega). PCR amplification was performed with Pfu
DNA polymerase (Stratagene). Restriction nucleases and ligase
were purchased from Boehringer Mannheim. E. coli was trans-
formed as described by Sambrook et al. (1989). Protoplasts from B.
subtilis were transformed as described by Cohen and Chang (1979).
The sequence of both strands of xynB and SPO2 promoter was
determined by automated fluorescence sequencing with an ABI
PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction mix (Perkin
Elmer) in a 377 Perkin Elmer DNA sequencer.
Enzyme assays
Cultures from Paenibacillus sp. BP-23, B. subtilis MW15/pRB-
SPOX20, E. coli-pX20 or E. coli-pX60 were centrifuged and
supernatants and pellets separated. Cells were disrupted by
sonication and enzyme activity of cell extracts and supernatants
was evaluated. To isolate the cytoplasmic fraction, cell extracts
were centrifuged at 8,000 g for 10 min and supernatants were
collected and centrifuged at 38,000 g for 60 min. Supernatants from
the last centrifugation were kept as cytoplasmic fraction while
pellets were resuspended in buffer and kept as membrane fraction.
Xylanase activity was assayed by measuring the amount of
reducing sugars released from xylans using the method of Nelson
and Somogyi (Spiro 1966). The xylans tested as substrates were
birchwood, oat spelt and beechwood xylan, methylglucuronoxylan
(Sigma Chemical), and rye or wheat arabinoxylan (Megazyme).
The assay mixture contained 0.5% xylan in a final volume of 0.1 ml
of 50 mM acetate buffer pH 5.5. The mixture was incubated at
40C for 15 min. Colour development was measured at 520 nm. To
227
study the activity on aryl-glycosides, the enzyme was incubated
with substrate for 5 min at 40C in a final volume of 0.25 ml of
100 mM acetate buffer pH 5.5. Substrate concentration was 0.5%
for p-nitrophenyl-b-d-xylopyranoside or o-nitrophenyl-b-d-xylopy-
ranoside; and 0.1% for p-nitrophenyl-b-d-glucopyranoside, p-
nitrophenyl-b-cellobioside, p-nitrophenyl-b-cellotrioside, p-nitro-
phenyl-b-cellotetraoside, p-nitrophenyl-b-cellopentaoside, p-nitro-
phenyl-a-l-arabinofuranoside or p-nitrophenyl-a-l-arabinopy-
ranoside (Sigma Chemical). The reaction was stopped by the
addition of 1 ml of 1 M Na2CO3 and colour development was
measured at 400 nm. One unit of enzymatic activity was defined as
the amount of enzyme that released 1 mol of reducing sugar
equivalent, p-nitrophenol or o-nitrophenol per minute under the
assay conditions described.
Gel electrophoresis and zymograms
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-
PAGE) was performed in 12% gels, essentially as described by
Laemmli (1970). Native gel electrophoresis was performed in 8%
polyacrylamide gels according to Hames and Rickwood (1981). For
the detection of xylanase activity, 0.2% birchwood xylan was
included in native gels before polymerization. Samples were heated
for 10 min at 50C in sample buffer before being applied to gels.
After electrophoresis, gels were washed in 50 mM phosphate
buffer, pH 7.0, for 30 min, and incubated at 37C for 30 min in the
same buffer. Gels were then stained with 0.1% Congo Red for
15 min and washed with 1 M NaCl until xylanase bands became
visible. Gels were then immersed in 5% (v/v) acetic acid and
photographed.
N-terminal sequencing of xylanase B
Xylanase protein bands were separated in SDS-PAGE gels and
transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes as
described (Packman 1993). N-terminal sequencing was determined
by automated Sanger degradation in a Beckman LF3000 sequencer.
Nucleotide sequence accession number
The DNA sequence of the xynB gene was deposited at the EMBL
database under accession number AJ006646.
Results
Substrate specificity of xylanase B
from Paenibacillus sp. BP-23
Recombinant E. coli-pX60, harbouring the xylanase B
encoding gene, was isolated previously from a gene
library made from Paenibacillus sp. BP-23 (Blanco et al.
1996). The enzymatic activity of cell extracts from E.
coli-pX60 on xylans having a different extent of arabinose
and methylglucuronic substitution, and on nitrophenol
derivatives of xylose, arabinose, glucose and cel-
looligosaccharides, was evaluated (Table 1). Xylanase B
showed similar specific activity on all tested xylans,
irrespective of the extent of substitution. The enzyme also
showed activity on most aryl-glycosides tested. Interest-
ingly, the specific activity on pNP-b-xyloside and oNP-b-
xyloside was similar to that found on xylans. The high
activity on aryl-xylosides could indicate that the enzyme
was a b-xylosidase. However, previous results had shown
228
Table 1 Substrate specificity of xylanase B
Substrate Specific activity
(U/mg)·103
Birchwood xylan 232.8
Oat spelt xylan 213.1
Beechwood xylan 248.7
Methylglucuronoxylan 192.8
Rye arabinoxylan 224.4
Wheat arabinoxylan 265.4
p-Nitrophenyl b-xylopyranoside 286.1
o-Nitrophenyl b-xylopyranoside 550.3
p-Nitrophenyl b-glucopyranoside 0.6
p-Nitrophenyl b-cellobioside 41.5
p-Nitrophenyl b-cellotrioside 42.5
p-Nitrophenyl b-cellotetraoside 42.1
p-Nitrophenyl b-cellopentaoside 31.4
p-Nitrophenyl a-arabinopyranoside 26.4 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of cell-associated and extracellular
p-Nitrophenyl a-arabinofuranoside 0.8 fractions from Bacillus subtilis MW15/pRBSPOX20. Bacillus
subtilis MW15/pRBSPOX20, carrying xynB, and control B. subtilis
MW15/pRBSPO were grown on nutrient broth supplemented with
0.2% birchwood xylan. Samples were taken after 3 days of
that although the enzyme was active on xylotetraose and incubation, fractionated into cell extracts and supernatants and
xylotriose, it did not hydrolyse xylobiose (Blanco et al. analysed by SDS-PAGE. Lane 1, cell extracts from Escherichia
coli-pBR322. Lane 2, cell extracts from E. coli-pX20, carrying
1996), clearly indicating that XynB is a xylanase. The xynB. Lane 3, concentrated supernatants from B. subtilis MW15/
high activity found on aryl xylosides could be the result of pRBSPOX20. Lane 4, concentrated supernatants from B. subtilis
transferase activity of xylanase B, as shown from the MW15/pRBSPO. Lane 5, cell extracts from B. subtilis MW15/
analysis of XynB hydrolysis products from xylotetraose pRBSPOX20. Lane 6, cell extracts from B. subtilis MW15/
(Blanco et al. 1996). pRBSPO. The positions of molecular weight markers are indicated

Genetic characterization of xynB

The sequence of the 1,219-bp DNA fragment from

Paenibacillus sp. BP-23 contained in pX60 was deter-
mined and submitted to the EMBL nucleotide sequence
database under accession number AJ006646. It contains
an open reading frame of 999 nucleotides that encodes a
protein of 332 amino acids with a predicted molecular
mass of 38,561 Da. This size is in agreement with that of
recombinant xylanase B produced in E. coli (40 kDa), as
determined from SDS-PAGE gels (Fig. 1). Seven nucle-
otides upstream of the ATG start codon there is an
AGGAGG sequence, resembling that of a ribosome-
binding site (Shine-Dalgarno).
Analysis of the deduced amino acid sequence of XynB
shows that the enzyme has an N-terminal region that lacks
the features of a signal peptide (Nagarajan 1993) (Fig. 2).
A stretch of 25–30 amino acids, containing a hydrophobic
core preceded by a few positively charged residues and
followed by a sequence recognized by bacterial signal
peptidases (Tjalsma et al. 1997) is not found in Paeni-
bacillus sp. BP-23 XynB. The absence of a signal peptide
in XynB was confirmed by SignalP and PSORT computer
analysis programs for the identification of signal peptides
(Nakai and Kanehisa 1992; Nielsen et al. 1999).
Cellular location of XynB from Paenibacillus sp. BP-23
Paenibacillus sp. BP-23 was cultured in nutrient broth
supplemented with birchwood xylan. High xylanase
Fig. 2 N-Terminal sequence of xylanase B. The sequence of the 50
amino acids from the N-terminus of xylanase B, and the
corresponding DNA encoding sequence is shown. The nucleotide
sequence resembling a ribosome binding site is underlined
activity was detected in culture supernatants from the
beginning of the stationary phase, reaching a maximum
after 2 days of culture. This activity corresponds to the set
of secreted xylanases previously described in the strain
(Blanco and Pastor 1993; Blanco et al. 1995, 1999).
Activity was also found in cell extracts, although it
represented only a small percentage of total activity (6%
in samples from late stationary-phase cultures).
To analyse the location of xylanase B, cell extracts and
extracellular fractions from early or late stationary-phase
cultures from Paenibacillus sp. BP-23 were analysed by
gel electrophoresis and zymograms. As XynB was
irreversibly inactivated by SDS, native gels were used
for the zymographic analysis. Paenibacillus sp. BP-23
culture supernatants showed several xylanase activity
bands: a well defined prominent band, corresponding to
the previously characterized xylanase C (Blanco et al.
1999), and a broad and diffuse band that extended up to
the upper limit of the gel, probably the result of

Fig. 3 Zymographic analysis of cell-associated and secreted xy-
lanases from Paenibacillus sp. BP-23. Paenibacillus sp. BP-23 was
cultivated on 0.2% birchwood xylan-supplemented nutrient broth.
Samples were taken after 17 h of incubation (early stationary phase)
or after 72 h (late stationary phase), fractionated in cell extracts and
supernatants, and analysed by native gel electrophoresis and
zymograms. Lanes: 1, concentrated supernatants from 17 h
cultures; 2, cell extracts from 17 h cultures; 3, concentrated
supernatants from 72 h cultures; 4, cell extracts from 72 h cultures.
Lane 5, control cell extracts from E coli-pX20 carrying xynB. Lane
6, control cell extracts from E- coli-pX31 carrying xynC. Arrows
indicate the activity bands corresponding to XynB and XynC
coalescence of less well defined bands (Fig. 3). The
activity bands detected showed different mobility to that
of xylanase B from recombinant E. coli-pX20 cells, used
as a control. The extracellular xylanase profile was
completely different from the zymographic pattern found
Fig. 4 Amino acid alignment of family 10 xylanases. Alignment of
the amino acid sequences flanking the conserved regions V and VI
of family 10 xylanases was performed using the ClustalW program.
The xylanases aligned are the 14 enzymes having the highest
homology to xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23, according
to Blast analysis of sequences from the Swissprot and EMBL
databases. The sequences shown are: Caldicellulosiruptor sp.
Tok7B.1 XynA (CspXynA), Dictyoglomus thermophilum XynA
(DthXynA), Caldicellulosiruptor sp XynC (CspXynC), Caldicel-
lulosiruptor saccharolyticus XynE (CsaXynE), Anaerocellum ther-
mophilum XynA (AthXynA), Caldibacillus cellulovorans XynA
(CceXynA), Caldicellulosiruptor sp. XynB (CspXynB), Aeromo-
nas punctata XynA (ApuXynX), Paenibacillus sp. BP-23 XynB
229
for the cell-associated xylanases. Cell extracts from
Paenibacillus sp. BP-23 showed a single xylanase band
with identical mobility to that of recombinant xylanase B,
while no other significant activity bands were detected.
The results indicate that xylanase B is not secreted to the
medium, but instead, remains cell-associated, even in late
stationary-phase cultures. Cell extracts were centrifuged
to separate membranes from the soluble fraction and
xylanase activity was evaluated. The soluble fraction
showed 97% of the activity associated to cells, indicating
that xylanase B is located in the cytoplasm of Paeni-
bacillus sp. BP-23.
Cloning of xylanase B in B. subtilis
Xylanase B was cloned and expressed in B. subtilis
MW15 (Wolf et al. 1995), which is devoid of background
xylanase activity. Cultures of recombinant B. subtilis
MW15/pRBSPOX20, harbouring xynB, produced xy-
lanase that initially remained cell-associated. However,
in late stationary-phase cultures (3 days), around 40% of
total activity was found at the supernatants, probably as a
result of cell lysis.
The cellular location of xylanase B in B. subtilis
MW15/pRBSPOX20 was also examined by SDS-PAGE.
Cell extracts and supernatants from 3-day-old cultures
showed a 40 kDa protein band, corresponding to xylanase
B, not found in control B. subtilis MW15/pRBSPO
cultures (Fig. 1). It is noteworthy that the enzyme
detected in the two locations showed identical mobility,
(PspXynB), Bacillus stearothermophilus T-6 XynA2 (BstXynA),
Bacillus stearothermophilus 21 Xyn2 (BstXyn2), Thermobacillus
xylanilyticus XynA (TxyXynA), Bacillus sp. N137 XyaA
(BspXyaA) and Caldicellulosiruptor saccharolyticus XynA
(CsaXynA); accession numbers: AF078737, Q12603, T31085,
T30910, Z69782, AF200304, T31082, AB015980, AJ006646,
AF098273, P45703, Y16849, I40356 and P23556, respectively.
Numbering of the amino acids starts at the N-termini of the
proteins. Gaps are indicated by dashes. Amino acids identical in at
least seven of the sequences aligned are shown in shadowed boxes.
Regions a and b, of conserved amino acids in xylanases from the
signal peptide-less group, are underlined
230
Fig. 5 Dendrogram of xylanases of family 10 based on amino acid
sequence homology. The dendrogram was generated with ClustalX.
The xylanases compared are the 14 enzymes with the highest
homology to XynB from Paenibacillus sp. BP-23, according to
suggesting the lack of processing of the xylanase found in
extracellular media. To confirm this, the N-terminal
sequence of xylanase B from supernatants and cell
extracts from B. subtilis MW15/pRBSPOX20, and also
from cell extracts from E coli-pX20, was determined.
Each of the three samples had the N-terminal sequence
STEIPSLSAS, deduced from xynB (Fig. 2).
Homology of xylanase B to enzymes from family 10
The deduced amino acid sequence of XynB was com-
pared to enzyme sequences contained in the Swissprot
and EMBL databases. Alignment by BLASTP (Altschul
et al. 1997) showed that xylanase B is a single-domain
enzyme with homology to xylanases of family 10
glycosyl hydrolases. The highest homology was found
to six of these enzymes: XynX from Aeromonas punctata
(Usui et al. 1999), XynA2 from Bacillus stearother-
mophilus T-6 (Shulami et al. 1999), XyaA from Bacillus
sp. N137 (Tabernero et al. 1995), Xyn2 from B.
Blast analysis, and those enzymes quoted by Baba et al. (1994) and
Fukumura et al. (1995) in the identification of conserved regions in
family 10 xylanases. The arrow indicates the group of seven
xylanases from the signal peptide-less group
stearothermophilus 21 (Baba et al. 1994), XynA from
Thermobacillus xylanilyticus (Connerton et al. 1999), and
XynA from Caldicellulosiruptor saccharolyticus (Lthi et
al. 1990), which showed 85, 57, 55, 55, 54 and 52%
identity to XynB from Paenibacillus sp. BP-23, respec-
tively (Fig. 4). Analysis of the deduced amino acid
sequences of these enzymes showed that, like xylanase B,
they do not show an N-terminal region with the features
of a signal peptide. This was verified by SignalP and
PSORT programs analysis for the identification of leader
peptides. Xylanases of family 10 show eight conserved
regions (Baba et al. 1994; Fukumura et al. 1995),
including the conserved sequences WDVVNE (region
III) and TELD (region VI) containing the two Glu
residues, Glu-134 and Glu-241 in the case of XynB,
proposed to be the catalytic acid-base and nucleophile
residues in family 10 xylanases (Harris et al. 1994;
Dominguez et al. 1995). Alignment of XynB from
Paenibacillus sp. BP-23 with the six signal peptide-less
xylanases allowed the identification of two additional
conserved regions, flanking region VI. The regions show

the amino acid sequences AIE_YASL (region a) and
RTDL__PT_EM (region b), and are not found in other
xylanases from family 10. Our results indicate that XynB
from Paenibacillus sp. BP-23 and six family 10 xylanases
constitute a distinctive group of highly homologous
enzymes that do not exhibit a signal peptide sequence.
A dendrogram of 28 xylanases of family 10 was generated
with the ClustalX program (Thompson et al. 1997)
(Fig. 5). This showed that xylanase B, together with the
xylanases from the signal peptide-less group, cluster
separately from the rest of the enzymes of family 10. The
identified group probably constitutes a new type of
xylanase with some specific action in the degradation of
plant xylan.
Discussion
Paenibacillus sp. BP-23 has a complex xylanolytic
system with multiple xylanases (Blanco and Pastor
1993), three of which (xylanases A, B and C) have been
characterized (see Blanco et al. 1995, 1999; this article).
This multiplicity of xylanases is similar to that found in
other microorganisms (Wong and Saddler 1992; Kulkarni
et al. 1999), where the cooperation of different xylanases
with distinctive action on xylan is assumed to favour
degradation of the polymer. Xylanase B from Paeni-
bacillus sp. BP-23 shows similar activity on xylans of
different rate of arabinose or methylglucuronic substitu-
tion. Similarly to other xylanases from family 10 (Biely et
al. 1997), the characterized enzyme does not require a
long stretch of unsubstituted xylose residues for the
cleavage of xylan.
Xylanase B from Paenibacillus sp. BP-23 seems to be
an intracellular enzyme. Several pieces of evidence
support this assumption. First, the enzyme does not show
a signal peptide. In accord with this, xylanase B was not
secreted to the extracellular media by Paenibacillus sp.
BP-23, but remained cell-associated, in the soluble
fraction. Additionally, when xynB was overexpressed in
B. subtilis, the enzyme was mainly cell-associated.
Xylanases are usually secreted to the extracellular
medium and accordingly, have a signal peptide. However,
XynB from Paenibacillus sp. BP-23 is a cell-associated
enzyme without a signal peptide. To our knowledge this is
the first example of a xylanase with these traits. Three
other xylanases without signal peptide have been reported
up to date, although no experimental evidence of their
location has been provided. These enzymes are: XynX
from Aeromonas punctata, XynA2 from Bacillus
stearothermophilus T6 and XyaA from Bacillus sp. strain
N137 (Usui et al. 1999; Shulami et al. 1999; Tabernero et
al. 1995). These enzymes have been proposed to be
intracellular or, alternatively, secreted to the extracellular
medium by a signal peptide-independent mechanism,
similar to ABC exporter systems described in Gram-
negative bacteria (Binet et al. 1997). A region of the B.
subtilis chromosome has been found to contain sequences
homologous to ABC transporter genes (Yamamoto et al.
231
1996). However, the significance of this region for
secretion of proteins in B. subtilis remains to be
established.
Analysis of sequence homology shows that xylanase B
from Paenibacillus sp. BP-23 belongs to family 10
glycosyl hydrolases and exhibits a distinctive higher
homology to six xylanases of this family: the three
xylanases without a signal peptide mentioned above and
Xyn2 from Bacillus stearothermophilus 21 (Baba et al.
1994), XynA from Thermobacillus xylanilyticus (Con-
nerton et al. 1999), and XynA from Caldicellulosiruptor
saccharolyticus (Lthi et al. 1990). These three latter
enzymes have also been shown after computer analysis to
be devoid of signal peptides. Xylanase B from Paeni-
bacillus sp. BP-23 and the six signal peptide-less
xylanases cluster separately from the rest of the family
10 xylanases and seem to constitute a separate group of
enzymes. Additionally, they show as a distinctive feature
the conserved amino acid stretches AIE_YASL and
RTDL__PT_EM, flanking region VI of family 10
xylanases. The 3-D structure of xylanase B, predicted
by the Swiss pdbViewer program (Guex and Peitsch
1997), is an (a/b)8 barrel, similar to family 10 enzymes.
Interestingly, the conserved stretch RTDL__PT_EM folds
as a random loop located in close proximity to the
substrate-binding cleft. This suggests that the residues in
this region can play a role in the catalytic properties of
xylanase B. Analysis of domains by the ProDom program
(Corpet et al. 2000) showed that xylanase B contains a
domain of 41 amino acids (ID: 277407) found exclusively
in the seven xylanases of the signal peptide-less group.
This domain contains the conserved stretch
RTDL__PT_EM and is located between regions VI and
VII of family 10 xylanases. This makes the spacing
between these conserved regions in xylanase B unusually
long.
Our data suggest that xylanase B, together with the six
signal peptide-less xylanases, form a new subclass of
family 10 xylanases of intracellular location. A cytoplas-
mic location would be in agreement with the fact that all
these xylanases are single-domain enzymes without
modules that mediate binding to insoluble substrates.
These xylanases probably hydrolyse short xylooligosac-
charides, resulting from extracellular xylan hydrolysis,
once they have been transported inside cells. Recently, a
periplasmic xylanase (XylC) has been characterized in
Cellvibrio mixtus (Fontes et al. 2000). The xylanase
shows a typical signal peptide (Fontes et al. 2000) and
does not show homology or clustering with the group of
signal peptide-less xylanases described in this paper.
The group of xylanases proposed here may differ from
extracellular xylanases in substrate specificity by some
subtle, not yet identified, traits. One of these could be
high activity on pNP-b-xyloside, which can suggest an
exo-type of catalytic activity. Although the occurrence of
true exoxylanases remains to be elucidated, this type of
mechanism has been proposed for xylanases from
Prevotella ruminicola and Aeromonas caviae (Gasparic
et al. 1995; Kubata et al. 1994). Our results indicate that
232
xylanase B belongs to a new group of xylanases, bearing
unusual features probably related to some specific, not yet
identified, function in degradation of plant xylan. The
biotechnological applications of this new subclass of
xylanases have not yet been evaluated, but their distinc-
tive properties make them good candidates for the
specific modification of xylan-containing substrates.
Acknowledgements We thank Monika Wolf for her gift of
bacterial strain Bacillus subtilis MW15 and Gaspar Prez-Gonzlez
for his gift of plasmid pRB473. We also thank Serveis Cientfico-
T cnics of the University of Barcelona for their support in
nucleotide sequencing, Servei de Prote
mica i Bioinformtica of Fukumura M, Sakka K, Shimada K, Ohmiya K (1995) Nucleotide
Universitat Aut
noma de Barcelona for the N-terminal sequencing sequence of the Clostridium stercorarium xynB gene encoding
of XynB and Margarita Soriano for technical aid in the construction
of pRBSPO. This work was partially supported by the Spanish
Ministry of Science and Technology (CICYT), project ref.
PPQ2000-0091-P4-04, and the Generalitat de Catalunya (III Pla
de Recerca, project. ref. 2001SGR 00143) and Centre de Refer ncia
en Biotecnologia (CerBa). Oscar Gallardo held a FI grant from
Generalitat de Catalunya.
References
Corpet F, Servant F, Gouzy J, Kahn D (2000) ProDom and
ProDom-CG: tools for protein domain analysis and whole
genome comparisons. Nucleic Acids Res 28:267–269
Davies G, Henrissat B (1995) Structure and mechanism of glycosyl
hydrolases. Structure 3:853–859
Dominguez R, Souchon H, Spinelli S, Dauter Z, Wilson KS,
Chauvaux S, Bguin P, Alzari PM (1995) A common protein
fold and similar active site in two distinct families of b-
glycanases. Nat Struct Biol 2:569–576
Fontes CMGA, Gilbert HJ, Hazlewood GP, Clarke JH, Prates JAM,
McKie VA, Nagy T, Fernandes TH, Ferreira LMA (2000) A
novel Cellvibrio mixtus family 10 xylanase that is both
intracellular and expressed under non-inducing conditions.
Microbiology 146:1959–1967
an extremely thermostable xylanase, and characterization of the
translated product. Biosci Biotechnol Biochem 59:40–46
Gasparic A, Martin J, Daniel AS, Flint HJ (1995) A xylan hydrolase
gene cluster in Prevotella ruminicola B14: sequence relation-
ships, synergistic interactions, and oxigen sensitivity of a novel
enzyme with exoxylanase and b-(1,4)-xylosidase activity. Appl
Environ Microbiol 61:2958–2964
Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RAJ
(1991) Domains in microbial b-1,4-glycanases: sequence
conservation, function, and enzyme families. Microbiol Rev
55:303–315
Guex N, Peitsch MC (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-
Altschul SF, Madden TL, Schffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller
W, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs. Nucleic Acids
Res 25:3389–3402
Baba T, Shinke R, Nanmori T (1994) Identification and character-
ization of clustered genes for thermostable xylan-degrading
enzymes, b-xylosidase and xylanase, of Bacillus stearother-
mophilus 21. Appl Environ Microbiol 60:2252–2258
Biely P, VrÐansk M, Tenkanen M, Kluepfel D (1997) Endo-b-1,4-
xylanase families: differences in catalytic properties. J Biotech-
nol 57:151–166
Binet R, Ltoff S, Ghigo JM, Delepelaire P, Wandersman C
(1997) Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC
exporters: a review. Gene 192:7-11
Blanco A, Pastor FIJ (1993) Characterization of cellulase-free
xylanases from the newly isolated Bacillus sp. strain BP-23.
Can J Microbiol 39:1162–1166
Blanco A, Vidal T, Colom JF, Pastor FIJ (1995) Purification and
properties of xylanase A from alkali-tolerant Bacillus sp. strain
BP-23. Appl Environ Microbiol 61:4468–4470
Blanco A, Daz P, Martnez J, L
pez O, Soler C, Pastor FIJ (1996) Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the
Cloning of a Bacillus sp. BP-23 gene encoding a xylanase with
high activity against aryl-xylosides. FEMS Microbiol Lett
137:285–290
Blanco A, Daz P, Zueco J, Parascandola P, Pastor FIJ (1999) A
multidomain xylanase from a Bacillus sp. with a region
homologous to thermostabilizing domains of thermophilic
enzymes. Microbiology 145:2163–2170
Brckner R (1992) A series of shuttle vectors for B. subtilis and E.
coli. Gene 122:187–192
Charnock SJ, Bolam DN, Turkenburg JP, Gilbert HJ, Ferreira
LMA, Davies GJ, Fontes CMGA (2000) The X6 "thermosta-
bilizing" domains of xylanases are carbohydrate-binding mod-
ules: structure and biochemistry of the Clostridium
thermocellum X6b domain. Biochemistry 39:5013–5021
Cohen SN, Chang S (1979) High frequency transformation of
Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA. Mol Gen Genet
168:111–115
Connerton I, Cummings N, Harris GW, Debeire P, Breton C (1999)
A single domain thermophilic xylanase can bind insoluble
xylan: evidence for surface aromatic clusters. Biochim Biophys
Acta 1433:110–121
PdbViewer: an environment for comparative protein modeling.
Electrophoresis 18:2714–2723
Hames BD, Rickwood D (1981) Gel electrophoresis of proteins: a
practical approach. IRL, Oxford University Press, Oxford
Harris GW, Jenkins JA, Connerton I, Cummings N, Lo Leggio L,
Scott M, Hazlewood GP, Laurie JI, Gilbert HJ, Pickersgill RW
(1994) Structure of the catalytic core of the family F xylanase
from Pseudomonas fluorescens and identification of the
xylopentaose-binding sites. Structure 2:1107–1116
Henrissat B, Bairoch A (1996) Updating the sequence-based
classification of glycosyl hydrolases. Biochem J 316:695–696
Keen NT, Boyd C, Henrissat B (1996) Cloning and characterization
of a xylanase gene from corn strains of Erwinia chrysanthemi.
Mol Plant Microb Interact 9:651–657
Kubata BK, Suzuki T, Horitsu H, Kawai K, Takamizawa K (1994)
Purification and characterization of Aeromonas caviae ME-1
xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan.
Appl Environ Microbiol 60:531–535
Kulkarni N, Shendye A, Rao M (1999) Molecular and biotechno-
logical aspects of xylanases. FEMS Microbiol Rev 23:411–456
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680–685
Lthi E, Love DR, McAnulty J, Wallace C, Caughey PA, Saul D,
Bergquist PL (1990) Cloning, sequence analysis, and expres-
sion of genes encoding xylan-degrading enzymes from the
thermophile Caldocellum saccharolyticum. Appl Environ Mi-
crobiol 56:1017–1024
Miyazaki K, Martin JC, Marinsek-Logar R, Flint HJ (1997)
Degradation and utilization of xylans by the rumen anaerobe
Prevotella bryantii (formerly P. ruminicola subsp. brevis) B14.
Anaerobe 3:373–381
Nagarajan, V (1993) Protein secretion. In: Sonenshein AL, Hoch
JA, Losick R (eds) Bacillus subtilis and other Gram-positive
bacteria. (Biochemistry, physiology, and molecular genetics)
American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp.
713–726
Nakai K, Kanehisa M (1992) A knowledge base for predicting
protein localization sites in eukaryotic cells. Genomics 14:879–
911
Nielsen H, Brunak SY, Heijne G (1999) Machine learning
approaches to the prediction of signal peptides and other
protein sorting signals. Protein Eng 12:3-9
Packman LC (1993) Protein chemical methods for molecular
biologists. Methods Mol Cell Biol 4:189–198

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y.
Schoner RG, Williams DM, Lovett PS (1983) Enhanced expression
of mouse dihydrofolate reductase in Bacillus subtilis. Gene
22:47–57
Shulami S, Gat O, Sonenshein A, Shoham Y (1999) The glucuronic
acid utilization gene cluster from Bacillus stearothermophilus
T-6. J Bacteriol 181:3695–3704
Spiro RG (1966) The Nelson-Somogyi copper reduction method:
analysis of sugars found in glycoprotein. Methods Enzymol
8:3-26
Tabernero C, Snchez-Torres J, Prez P, Santamara RI (1995)
Cloning and DNA sequencing of xyaA, a gene encoding an
endo-b-1,4-xylanase from an alkalophilic Bacillus strain
(N137). Appl Environ Microbiol 61:2420–2424
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG
(1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.
Nucleic Acids Res 24:4876–4882
Tjalsma H, Noback MA, Bron S, Venema G, Yamane K, Dijl, JM
van (1997) Bacillus subtilis contains four closely related type I
233
signal peptidases with overlapping substrate specificities. J Biol
Chem 272:25983–25992
Tomme P, Boraston A, McLean B, Kormos J, Creagh AL, Sturch
K, Gilkes NR, Haynes CA, Warren RAJ, Kilburn DG (1998)
Characterization and affinity applications of cellulose-binding
domains. J Chromatogr B 715:283–296
Usui K, Ibata K, Suzuki T, Kawai K (1999) XynX, a possible exo-
xylanase of Aeromonas caviae ME-1 that produces exclusively
xylobiose and xylotetraose from xylan. Biosci Biotechnol
Biochem 63:1346–1352
Wolf M, Geczi A, Simon O, Borriss R (1995) Genes encoding
xylan and b-glucan hydrolysing enzymes in Bacillus subtilis:
characterization, mapping and construction of strains deficient
in lichenase, cellulase and xylanase. Microbiology 141:281–
290
Wong KKY, Saddler JN (1992) Trichoderma xylanases, their
properties and application. Crit Rev Biotechnol 12:413–435
Yamamoto H, Uchiyama S, Sekiguchi J (1996) The Bacillus
subtilis chromosome region near 78 contains the genes
encoding a new two-component system, three ABC transporters
and a lipase. Gene 181:147–151
CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 48 (2004), pp. 276 –279
DOI: 10.1007/s00284-003-4196-0 Current
Microbiology
An International Journal
© Springer-Verlag New York LLC 2004

Cloning and Characterization of Xylanase A from the Strain Bacillus

sp. BP-7: Comparison with Alkaline pI-Low Molecular Weight
Xylanases of Family 11
Óscar Gallardo, Pilar Diaz, F.I. Javier Pastor
Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avinguda Diagonal 645, 08028 Barcelona, Spain

Received: 16 July 2003 / Accepted: 15 August 2003

Abstract. The xynA gene encoding a xylanase from the recently isolated Bacillus sp. strain BP-7 has been
cloned and expressed in Escherichia coli. Recombinant xylanase A showed high activity on xylans from
hardwoods and cereals, and exhibited maximum activity at pH 6 and 60°C. The enzyme remained stable
after incubation at 50°C and pH 7 for 3 h, and it was strongly inhibited by Mn2⫹, Fe3⫹, Pb2⫹, and Hg2⫹.
Analysis of xylanase A in zymograms showed an apparent molecular size of 24 kDa and a pI of above
9. The amino acid sequence of xylanase A, as deduced from xynA gene, shows homology to alkaline
pI-low molecular weight xylanases of family 11 such as XynA from Bacillus subtilis. Analysis of codon
usage in xynA from Bacillus sp. BP-7 shows that the G⫹C content at the first and second codon positions
is notably different from the mean values found for glycosyl hydrolase genes from Bacillus subtilis.

Biodegradation of xylan, a major component of plant cell
walls, is a complex process that requires the coordinate
action of several enzymes, among which xylanases (1,4-
␤-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving inter-
nal linkages on the ␤-1,4-xylose backbone, play a key
role. Based on amino acid sequence homologies and
hydrophobic cluster analysis, xylanases have been clas-
sified in two groups, family 10 and family 11 [7, 9].
However, xylanases homologous to family 5 ␤-gly-
canases have also been found [10]. The complex chem-
ical nature and heterogeneity of xylan can account for the
multiplicity of xylanases produced by microorganisms
[11]. Members of the genus Bacillus produce many dif-
ferent xylanases, several of which have been cloned and
characterized [2, 8, 14]. The activity of different xyla-
nases with subtle differences in substrate specificity and
mode of action should improve degradation of plant
xylan in natural habitats.
The alkali-tolerant strain Bacillus sp. BP-7 secretes
high xylanase activity in media supplemented with xy-
lose and shows a complex xylanolytic system [13]. In
this article we describe the cloning and sequencing of the
Correspondence to: F.I.J. Pastor; email: fpastor@bio.ub.es
gene encoding xylanase A from Bacillus sp. BP-7, and
the characterization of the enzyme.
Materials and Methods
Nucleic acids manipulation. Plasmid DNA was purified by the alka-
line lysis procedure [16] or by chromatography (QIAGEN-tip 100
MidiPrep, Promega). Restriction nucleases and ligase were purchased
from Boehringer Mannheim. Escherichia coli XL1-Blue was trans-
formed as described [16]. The sequences of both strands of xynA,
contained in plasmid pXA30, were determined by automated fluores-
cence sequencing with an ABI PRISM dye terminator cycle sequencing
ready reaction mix (Perkin Elmer) in a 377 Perkin Elmer DNA se-
quencer. Sequence homology was analyzed through BLAST [1].
Enzyme assays. Escherichia coli/pXA30 was grown on ampicillin
supplemented LB broth at 37°C for 16 h, and cells were collected and
disrupted by sonication. Xylanase activity on cell extracts was assayed
as described [5]. The assay mixture contained 0.5% (wt/vol) xylan,
pNP-␤-xyloside, oNP-␤-xyloside, pNP-␤-glucopyranoside, pNP-␣-ar-
abinofuranoside or pNP-␣-arabinopyranoside (Sigma Chemical Co.) in
a final volume of 0.1– 0.25 mL of 50 mM Tris-HCl buffer pH 6. The
mixture was incubated at 60°C for 15 min. Color development was
measured at 520 nm for xylans and 400 nm for oNP and pNP deriva-
tives. One unit of enzymatic activity was defined as the amount of
enzyme that releases 1 ␮mol of reducing sugar equivalent, p-nitrophe-
nol or o-nitrophenol per minute under the assay conditions described.
Gel electrophoresis and zymograms. Sodium dodecyl sulfate poly-
acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12%
gels essentially as described by Laemmli [12]. For detection of xyla-
Ó. Gallardo et al.: Xylanase A from Bacillus sp. BP-7 277

nase activity, 0.2% (wt/vol) birchwood xylan was included in the gels Table 1. Substrate specificity of crude xylanase A
before polymerization. Samples were heated for 10 min at 45°C in
sample buffer before being applied to gels. After electrophoresis, gels Specific activity
were soaked in 2.5% (wt/vol) Triton X-100 for 30 min, washed in 50 Substrate (U/mg)a
mM phosphate buffer pH 7 for 30 min, and incubated at 37°C for 15
min in the same buffer. Gels were stained with 0.1% (wt/vol) Congo Birchwood xylan 0.182
red for 15 min and washed with 1 M NaCl until xylanase bands became Beechwood xylan 0.207
visible. Gels were then immersed in 5% (wt/vol) acetic acid, in which Methylglucuronoxylan 0.139
the background turned dark blue, and photographed. Oat spelt xylan 0.145
Isoelectric focusing (IEF) was performed with a Pharmacia Phast- Wheat arabinoxylan 0.164
System unit. Gels with a pH range from 3.0 to 9.0 (Amersham Phar- Rye arabinoxylan 0.054
macia Biotech AB) were used. After electrophoresis, gels were overlaid Carboxymethyl cellulose ND
with 1% agarose gels containing 0.5% (wt/vol) birchwood xylan, Avicel ND
incubated for 45 min at 37°C, stained with Congo red, and washed with Laminarin ND
NaCl. Lichenan 0.003
Polygalacturonate ND
Nucleotide sequence accession number. The DNA sequence of xynA
Pectin 0.003
gene was submitted to the EMBL database under accession number
Starch 0.003
AJ536759.
pNPX 0.001
oNPX 0.001
pNPG 0.001
Results and Discussion pNPAp 0.001
Cloning of xylanase A encoding gene. A gene library pNPAf 0.002
from Bacillus sp. BP-7, previously constructed in Es- a
ND, not detected.
cherichia coli [15], was screened for xylanase activity on
agar LB plates containing 0.1% (wt/vol) Remazol Bril-
liant Blue R-D-Xylan. Six clones out of the 4500 tested enzyme remained stable at 50°C and pH 7 for at least 3 h
showed clear halos around the bacterial growth and were (Fig. 1). However, at 60°C, the enzyme lost 78% of its
selected. Four of these clones carried recombinant plas- activity after 15 min incubation. The effect of different
mids with different inserts that contained a common metal ions at a concentration of 10 mM on xylanase A
DNA segment of 3.8 kb. The smallest of these plasmids activity was also determined. The enzyme was com-
was digested with HindIII, and fragments were inserted pletely inhibited by Mn2⫹, while strong inhibition was
in pUC19. After transformation in Escherichia coli, a caused by Fe3⫹, Pb2⫹, and Hg2⫹ (3.0, 12.9, and 22.4%
clone harboring plasmid pXA30, containing a 1.6 kb residual activity, respectively). Little inhibition was
DNA insert and expressing xylanase activity, was chosen caused by Cu2⫹, Zn2⫹, Ni2⫹, Ag2⫹, Co2⫹, and Ca2⫹.
for further experiments. Mg2⫹ did not affect enzyme activity, while Ba2⫹ pro-
duced a small stimulating effect.
Properties of the enzyme. The activity of the enzyme
The gene product contained in pXA30 was charac-
produced by the recombinant clone was tested on several
terized by SDS-PAGE and zymographic analysis. An
polysaccharides. Cells from E. coli/pXA30 cultures were
intense and well-defined xylanase activity band, showing
disrupted by sonication, and the lysates obtained were
an apparent molecular weight of 24 kDa, was found in
assayed for activity. High hydrolytic activity was found
zymograms from E. coli/pXA30 (Fig. 2). The xylanase
on most xylans tested, showing the maximum value on
band was not detected in extracts from control cells from
beechwood xylan, while activity on highly arabinose-
E. coli/pUC19. Analysis of the recombinant enzyme in
substituted xylan from rye was considerably lower (Ta-
isoelectric focusing gels and zymograms showed a
ble 1). Cloned enzyme showed very low activity on
unique and prominent activity band in the upper pH limit
pNP-xyloside and other aryl-glycosides tested. Activity
of the gel, indicating xylanase A has a pI of 9.0 or higher
was not detected on carboxymethyl cellulose or Avicel,
(Fig. 2).
and no significant activity was found on other polysac-
charides. The results obtained indicate the cloned en- Analysis of xylanase coding sequence. The nucleotide
zyme is an endoxylanase. We call the enzyme XynA. sequence of the 1394 bp DNA insert of pXA30 was
The effects of pH and temperature on the activity of determined. It contained an open reading frame of 639 bp
xylanase A were determined. Optimum conditions for encoding a protein of 213 amino acids with deduced
activity were 60°C and pH 6. The enzyme was highly molecular weight and isoelectric point of 23,475 Da and
active in a wide range of pH, showing more than 50% of 9.28, respectively, in agreement with results from zymo-
maximum xylanase activity in the pH range from 4.5 to graphic analysis. Alignment of the deduced amino acid
8.5 (Fig. 1). Thermostability assays indicated that the sequence of xynA to ␤-glycanase sequences contained in
278
Fig. 2. Electrophoretic analysis of xylanase A. (A) Coomassie Blue-
stained SDS polyacrylamide gel. (B) Zymogram of an SDS polyacryl-
amide gel. (C) Zymogram of an isoelectric focusing gel. Lanes 1:
Control cell extracts from Escherichia coli/pUC19; lanes 2: cell ex-
tracts from Escherichia coli/pXA30. The positions of molecular weight
standards and of pI markers are indicated.
Swissprot and EMBL databases showed that xylanase A
from Bacillus sp. BP-7 is a single domain enzyme with
homology to xylanases of family 11. The cloned enzyme
seems to belong to the type of “alkaline pI-low molecular
weight xylanases”, that was proposed to constitute the
core group of family 11 glycanases, and that seems to be
ubiquitous among Bacillus species [17]. However, this
type of xylanase is differently conserved among the
different isolates and species of the genus. In this way,
xylanase A from Bacillus sp. BP-7 shows 92% identity
with the low-molecular-weight xylanases from B. subtilis
[14], B. circulans [18], and Bacillus sp. YA-14 [19],
while the identity found with XynA from B. stearother-
mophilus [3], XynN from B. halodurans [EMBL acces-
sion number AY170624], XynA from B. pumilus [4], and
CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 48 (2004)
Fig. 1. Effect of pH and temperature on xylanase A
activity. (A) Effect of pH on activity of XynA. (B)
Thermal stability of XynA at pH 7 and 50°C (F),
55°C (E), or 60°C (}).
XynA from B. agaradhaerens [EMBL accession number
A68006] was only 78, 75, 46, and 45%, respectively.
A recent report on codon usage in glycosyl hydro-
lases shows that the G⫹C content at the first and second
codon positions of xynA from B. subtilis (38.3 and
52.8%, respectively) differs widely from the average
G⫹C content at the same codon positions of glycosyl
hydrolase genes of this microorganism (51.7 and 37.7%,
respectively) [6]. Similar results have been found for
xynA from B. circulans, suggesting that these genes have
been acquired by horizontal gene transfer, through trans-
duction mediated by prophage 6, probably from an ac-
tynomycetes-related organism. Interestingly, the G⫹C
content values at the first and second codon positions of
xynA from Bacillus BP-7 (38.2 and 52.1%, respectively),
are similar to those found in B. subtilis xynA. The results
found suggest that the cloned xylanase corresponds to a
highly conserved enzyme that has probably been ac-
quired by Bacillus sp. BP-7 by horizontal gene transfer
from a related Bacillus strain.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Serveis Cientı́fico-Tècnics of the University of Barcelona for
their support in nucleotide sequencing. This work was partially sup-
ported by the Spanish Ministery of Science and Technology (CICYT),
project ref. PPQ2000-0091-P4-04; the Generalitat de Catalunya (III Pla
de Recerca, project. ref. 2001SGR 00143); and Centre de Referència en
Biotecnologia (CeRBa). Óscar Gallardo held an FI grant from the
Generalitat de Catalunya.
Literature Cited
1. Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller
W, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new
generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res
25:3389 –3402
2. Blanco A, Dı́az P, Zueco J, Parascandola P, Pastor FIJ (1999) A
multidomain xylanase from a Bacillus sp. with a region homolo-
gous to thermostabilizing domains of thermophilic enzymes. Mi-
crobiology 145:2163–2170
3. Cho S, Choi Y (1995) Nucleotide sequence analysis of an endo-
xylanase gene (xynA) from Bacillus stearothermophilus. J Micro-
biol Biotechnol 5:117–124
Ó. Gallardo et al.: Xylanase A from Bacillus sp. BP-7
4. Fukusaki E, Panbangred W, Shinmyo A, Okada H (1984) The
complete nucleotide sequence of the xylanase gene (xynA) of
Bacillus pumilus. FEBS Lett 171:197–201
5. Gallardo Ó, Diaz P, Pastor FIJ (2003) Characterization of a Paeni-
bacillus cell-associated xylanase with high activity on aryl-xylo-
sides: A new subclass of family 10 xylanases. Appl Microbiol
Biotechnol 61:226 –233
6. Garcia-Vallvé S, Palau J, Romea A (1999) Horizontal gene transfer
in glycosyl hydrolases inferred from codon usage in Escherichia
coli and Bacillus subtilis. Mol Biol Evol 16:1125–1134
7. Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RAJ
(1991) Domains in microbial ␤-1,4-glycanases: Sequence conser-
vation, function, and enzyme families. Microbiol Rev 55:303–315
8. Gupta N, Reddy VS, Maiti S, Ghosh A (2000) Cloning, expression
and sequence analysis of the gene encoding the alkali-stable,
thermostable endoxylanase from alkalophilic, mesophilic Bacillus
sp. strain NG-27. Appl Environ Microbiol 66:2631–2635
9. Henrissat B, Bairoch A (1996) Updating the sequence-based clas-
sification of glycosyl hydrolases. Biochem J 316:695– 696
10. Keen NT, Boyd C, Henrissat B (1996) Cloning and characteriza-
tion of a xylanase gene from corn strains of Erwinia chrysanthemi.
Mol Plant-Microbe Interact 9:651– 657
11. Kulkarni N, Shendye A, Rao M (1999) Molecular and biotechno-
logical aspects of xylanases. FEMS Microbiol Rev 23:411– 456
279
12. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680 – 685
13. López C, Blanco A, Pastor FIJ (1998) Xylanase production by a
new alkali-tolerant isolate of Bacillus. Biotechnol Lett 20:243–246
14. Paice MG, Bourbonnais R, Desrochers M, Jurasek L, Yaguchi M
(1986) A xylanase gene from Bacillus subtilis: nucleotide se-
quence and comparison with B. pumilus gene. Arch Microbiol
144:201–206
15. Prim N, Pastor FIJ, Diaz P (2001) Cloning and characterization of
a bacterial cell-bound type B carboxylesterase from Bacillus sp.
BP-7. Curr Microbiol 42:237–240
16. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: A
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring
Harbor Laboratory Press
17. Wong KKY, Tan LUL, Saddler JN (1988) Multiplicity of ␤-1,4-
xylanase in microorganisms: Functions and applications. Micro-
biol Rev 52:305–317
18. Yang RCA, MacKenzie R, Bilous D, Narang SA (1989) Hyper-
expression of a Bacillus circulans xylanase gene in Escherichia
coli and characterization of the gene product. Appl Environ Mi-
crobiol 55:1192–1195
19. Yu JH, Park YS, Yum DY, Kim JM, Kong IS, Bai DH (1993)
Nucleotide sequence and analysis of a xylanase gene (xynS) from
alkali-tolerant Bacillus sp. YA-14 and comparison with other xy-
lanases. J Microbiol Biotechnol 3:139 –145
Use of the Cell Wall Protein Pir4
as a Fusion Partner for the Expression
of Bacillus sp. BP-7 Xylanase A in
Saccharomyces cerevisiae

Isabel Andrés,1 Oscar Gallardo,2 Palma Parascandola,3

F.I. Javier Pastor,2 Jesús Zueco1
1
Unidad de Microbiologı́a, Facultad de Farmacia, Univ. De Valencia,
Avda. Vicente Andrés Estelles s/n. 46100-Burjassot (Valencia), Spain;
telephone: 34-963543605; fax: 34-963544299;
e-mail: jesus.zueco@ uv.es
2
Dep. Microbiologia, Fac. Biologı́a, Univ. Barcelona, Avinguda Diagonal 645,
08028-Barcelona, Spain
3
Dip. di Ingegneria Chimica e Alimentare, Università degli Studi di Salerno,
Via Ponte Don Melillo 1, I-84084 Fisciano, SA, Italy
Received 7 July 2004; accepted 14 October 2004

Published online 31 January 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/bit.20375

Abstract: Xylanase A from Bacillus sp. BP7, an enzyme INTRODUCTION

with potential applications in biotechnology, was used to
test Pir4, a disulfide bound cell wall protein, as a fusion
partner for the expression of recombinant proteins in
standard or glycosylation-deficient mnn9 strains of Sac-
charomyces cerevisiae. Five different constructions were
carried out, inserting in-frame the coding sequence of
xynA gene in that of PIR4, with or without the loss of
specific regions of PIR4. Targeting of the xylanase fusion
protein to the cell wall was achieved in two of the five
constructions, while secretion to the growth medium was
the fate of the gene product of one of the constructions. In
all three cases localization of the xylanase fusion proteins
was confirmed both by Western blot and detection with
Pir-specific antibodies and by xylanase activity determi-
nation. The cell wall-targeted fusion proteins could be
extracted by reducing agents, showing that the inclusion
of a recombinant protein of moderate size does not af-
fect the way Pir4 is attached to the cell wall. Also, the
construction that leads to the secretion of the fusion
protein permitted us to identify a region of Pir4 responsible
for cell wall retention. In summary, we have developed a
Pir4-based system that allows selective targeting of an
active recombinant enzyme to the cell wall or the growth
medium. This system may be of general application for the
expression of heterologous proteins in S. cerevisiae for
surface display and secretion. B 2005 Wiley Periodicals, Inc.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae; Pir cell wall pro-
teins; recombinant protein expression; cell wall targeting;
secretion; xylanase
Correspondence to: Jesús Zueco
Contract grant sponsors: Ministerio de Ciencia y Tecnologı́a (Spain);
Generalitat Valenciana
Contract grant numbers: BMC2001-2761; Grupos 03/106, and a
predoctoral grant (to I.A.)
The cell wall of the yeast Saccharomyces cerevisiae is
made of three main components: h-1,6 and h-1,3-glucans,
chitin, and mannoproteins. Glucans and chitin are localized
to the inner part of the cell wall and are responsible for the
structural strength and the shape of the cell wall, while
mannoproteins are localized to the surface of the cells and
their main role seems to be structural and that of mediating
with the environment (Klis, 1994; Klis et al., 2002). A
biotechnologically interesting feature of S. cerevisiae, first
demonstrated by Schreuder et al. (1993), is the possibility
to immobilize heterologous enzymes on the cell surface by
fusing them to a cell wall protein, creating in this way an
easy-to-separate reusable biocatalyst (Schreuder et al.,
1996). Different groups of cell wall mannoproteins (CWPs)
have been used as partners for the targeting of recombinant
fusion proteins to the yeast cell wall: that of the glucanase-
extractable GPI-CWPs, which are linked to h-1,6-glucan
through the remnant of a glycosylphosphatidylinositol
group, the Pir-CWP group, supposedly linked to h-1,3-
glucan through alkali-sensitive linkages, and that of the
disulphide-bound cell wall proteins. GPI-CWPs have been
used as fusion partners for the targeting of a reporter
enzyme to the cell wall (Schreuder et al., 1993; Van der
Vaart et al., 1997), for the immobilization of glucolytic
enzymes on the cell surface to create a starch-utilizing yeast
(Murai et al., 1997a,b, 1998, 1999; Sato et al., 2002), for
the expression of lipases (Schreuder et al., 1996; Washida
et al., 2001; Matsumoto et al., 2002), or for the surface
display of the staphylococcal protein A (Andrés et al.,
2003), while Pir1 and Pir2, two Pir-CWPs, have been used
for the cell wall targeting of different glycosyltransferases

B 2005 Wiley Periodicals, Inc.

so as to create single-cell biocatalysts (Abe et al., 2003,
2004). Finally, Aga2p, a disulphide-bound CWP, has been
used as a carrier to present a library of antibody fragments
on the cell surface (Boder and Wittrup, 1997; Kieke at al.,
1997, Wittrup, 2001).
Pir4 belongs to the so-called Pir (proteins with internal
repeats) family of S. cerevisiae cell wall proteins (Toh-e
et al., 1993; Mrsa et al., 1997; Klis et al., 2002), which
are supposed to be directly attached to h-1,3-glucan.
However, two of the four PIR-CWPs described, Pir4 and
Pir2/Hsp150, are secreted to the medium to a variable
degree (Russo et al., 1992; Moukadiri and Zueco, 2001)
and can be specifically extracted from isolated cell walls
by reducing agents (Moukadiri et al., 1999; Moukadiri and
Zueco, 2001) and, accordingly, they can be included
among the disulphide-bound cell wall proteins. In this
work, we describe the use of Pir4 for the targeting of
xylanase A from Bacillus sp. BP-7 to the yeast cell wall
or to the culture medium. Xylan is a complex polymer
of plant cell walls that is second only to cellulose in
abundance in nature. The xylanases, which are the en-
zymes responsible for the depolymerization of the xylan
backbone, have attracted interest because of their poten-
tial biotechnological application in pulp bleaching and
in the food and animal feed industries (Maat et al.,
1992; Beauchemin et al., 1995; Luonteri et al., 1996).
S. cerevisiae does not naturally secrete xylanases and
cannot degrade xylan (Jeffries, 1983); however, it is an
attractive host for the expression and production of
recombinant xylanases (Li and Ljungdahl, 1996; Peréz-
Gonzaléz et al., 1996; Ganga et al., 1999; La Grange
et al., 2001). It provides for posttranslational processing
such as proteolytic cleavage and glycosylation and, since
it normally secretes few proteins and in low abundance,
a secreted heterologous protein is easily separated from
most other yeast proteins. Furthermore, it is a GRAS
(generally regarded as safe) organism, which allows
for its use in the food and pharmaceutical industries,
and there is ample experience in its growth in indus-
trial fermentors.
MATERIALS AND METHODS
Strains and Media
Escherichia coli DH5a was used for the propagation of
plasmids; it was grown in Luria broth supplemented with
100 Ag of ampicillin per ml when necessary. The
S. cerevisiae strains BY4741 (MATa, ura3
0, leu2
0,
met15
0, his3
1) and mnn9 (MATa, ura3
0, leu2
0,
met15
0, his3
1, ypl050c::kanMX4) used in this study
were obtained from the EUROSCARF collection (Heidel-
berg, Germany). Yeast strains were grown in YPD (1%
yeast extract, 2% bacto peptone, 2% glucose) or synthetic
minimal medium SD (0.7% yeast nitrogen base without
amino acids, 2% glucose, and amino acids as required).
ANDRÉS ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE
Reagents
Agar, yeast extract, peptone, and yeast nitrogen base were
purchased from Difco Laboratories (Detroit, MI); phenyl-
methylsulphonylfluoride (PMSF) was from Roche (Nutley,
NJ); DNA restriction and modification enzymes were from
Roche, New England Biolabs (Beverly, MA), and Amer-
sham-Pharmacia (Amersham, UK). Tris-base, HCl, and
other buffer reagents were purchased from Sigma Chemical
(St. Louis MO) and from Panreac (Barcelona, Spain).
Electrophoresis reagents were from Bio-Rad Laboratories
(Hercules, CA). Nitrocellulose membranes and the chemi-
luminescence ECL reagents for developing Western
immunoblots were from Amersham. Goat antirabbit IgG-
peroxidase was from Bio-Rad.
Transformation of Strains, DNA Isolation,
and Sequencing
Basic DNA manipulation and transformation in E. coli was
performed as described by Sambrook et al. (1989). Yeast
transformation was carried out by the lithium acetate
method (Ito et al., 1983; Gietz and Sugino, 1988). Plasmid
DNA from E. coli was prepared using the Flexi-Prep kit
(Amersham-Pharmacia) and DNA fragments were purified
from agarose gels using the Sephaglass Band-Prep kit, also
from Amersham-Pharmacia. Sequencing was performed
using Amplytaq polymerase with a Dye Terminator kit
(Perkin Elmer, Norwalk, CT) in an Applied Biosystems
(Foster City, CA) 373A automatic sequencer.
Construction of the Different Gene Fusions
Between PIR4 and XYNA
The first step consisted of subcloning the complete
sequence of the PIR4 gene into vector YEplac195 (Gietz
and Sugino, 1988), whose SalI restriction site had been
previously destroyed. For this, YEplac195 was digested
with PstI and XbaI and the resulting protruding ends were
filled in with Klenow and ligated with the loss of the PstI,
HincII, SalI, and XbaI sites from the polylinker of
YEplac195. The complete sequence of PIR4, including
its regulatory sequences, was amplified by PCR using
oligonucleotides PIR5V and PIR3V (Table I) and Expand High
Fidelity Polymerase from Roche. The resulting 1.2-Kbp
fragment was subcloned in the SmaI site of YEplac195,
previously modified as described above, to give construc-
tion pIA1.
Constructions C1 to C3 consisted of the insertion of the
coding sequence of Bacillus sp. BP7 xynA gene (Gallardo
et al., 2004), minus the 5V region coding the leader peptide,
in the NcoI, BglII, and SalI sites of PIR4. For this, a 569-bp
fragment of xynA was amplified using the oligonucleo-
tides XNCO5-XNCO3, XBGL5-XBGL3, XSAL5-XSAL3
(Table I), and plasmid pXA3V1 (Gallardo et al., 2004)
as template. The oligonucleotides included the restriction
691
Table I. Oligonucleotides used to amplify the coding sequence of the
xynA gene minus the region coding for the leader peptide.
Oligonucleotide Sequence
PIR5V TGCATTCCATACGATTTCCACGGG
PIR3V GTGTATATTAAAGGCTGCATGTGG
XNCO5 AATTAACCATGGGCTAACACAGACTACTGGC
XNCO3 AAAAATCCATGGCCACACTGTGACGTTAGAAC
XSAL5 AATTAACTCGAGGCTAACACAGACTACTGGC
XSAL3 TATATACTCGAGCCACACTGTGACGTTAGAAC
XBGL5 AATTAAGGATCCTAGCTAACACAGACTACTGGC
XBGL3 TATATAGGATCCACACTGTGACGTTAGAAC
sites for the enzymes NcoI, BamHI, which leaves overhangs
compatible with those left by BglII, and XhoI, which leaves
overhangs compatible with the overhangs left by SalI, and
had been designed so that the xynA fragment was inserted
in-frame in PIR4 in construction pIA1. The PCR fragments
amplified using Expand High Fidelity DNA polymerase
(Roche) were subcloned in the HincII site of pUC19;
digested out with NcoI, BamHI, or XhoI, and inserted in
pIA1 previously digested by NcoI, BglII, or SalI. The
correct orientation of the inserts was monitored by PCR
performed directly on the colonies of transformants using
oligonucleotides PIR5V and the corresponding 3V oligonu-
cleotides used in the amplification of xynA (Table I).
Constructions C4 and C5 involved the substitution of
fragments of PIR4 by the coding sequence of xynA. In C4,
the 567-bp fragment of xynA was amplified using
oligonucleotides XBGL5 and XSAL3 (Table I) and
plasmid pXA3V1 as template, subcloned in the HincII site
of pUC19; digested out with BamHI and XhoI and
subcloned in pIA1 previously digested with enzymes BglII
and SalI with the loss of 365 bp of the 5V region of the
PIR4 ORF. Finally, to create construction C5, the 567-bp
fragment of xynA was amplified using oligonucleotides
XNCO5 and XSAL3 (Table I) and plasmid pXA3V1 as tem-
plate, subcloned in the HincII site of pUC19; digested out
with NcoI and XhoI and subcloned in pIA1 previously
digested with enzymes NcoI and SalI with the loss of 588 bp
of the PIR4 ORF. Constructions C4 and C5 were moni-
tored by PCR using oligonucleotides PIR3V and either
XBGL5 or XNCO5 (Table I).
Isolation of Cell Wall Mannoproteins
Cell walls were purified and extracted with h-mercaptoeth-
anol as follows: cells in the early logarithmic phase were
harvested and washed twice in Tris-HCl 10 mM, pH 7.4,
1 mM in PMSF (buffer A). The harvested biomass was
resuspended in buffer A in a proportion of 2 ml per gram
(wet weight), glass beads (0.45 mm in diameter) were added
up to 50% of the final volume, and the cells were broken by
shaking four times for 30 sec, with 1-min intervals, in a CO2
refrigerated MSK homogenizer (Braun Melsungen, Ger-
692 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 89, NO. 6, MARCH 20, 2005
many). Breakage was confirmed by phase contrast micro-
scopy and the walls were washed six to eight times in buffer
A. Removal of noncovalently bound proteins was achieved
by boiling the walls in buffer A containing 2% SDS (10 ml
per gram of walls, wet weight) for 10 min, followed by six
to eight washes in buffer A. The purified cell walls were
finally resuspended in 10 mM ammonium acetate buffer,
pH 6.3, containing 2% (v/v) h-mercaptoethanol (5 ml per
gram of walls, wet weight) and incubated for 3 h at 30jC in
an orbital incubator at 200 rpm. The extract was separated
from the cell walls by centrifugation and concentrated by
lyophilization. Cell walls to be used in the xylanase activity
determinations were washed six to eight times in buffer A
and used directly.
SDS-Polyacrylamide Gels and Western Blot Analysis
Proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel elec-
trophoresis (SDS-PAGE) according to the method of
Laemmli (1970) in 10% polyacrylamide gels. The proteins
separated by SDS-PAGE were transferred onto Hybond-C
nitrocellulose membranes as described by Towbin et al.
(1979) and Burnette (1981). Membranes were blocked
overnight in Tris-buffered saline containing 0.05% Tween-
20 (TBST) and 5% nonfat milk. The blocked membranes
were washed three times in TBST and incubated for 1 h
in TBST containing an antibody that reacts with Pir cell
wall proteins (Moukadiri et al., 1999) at a dilution of
1:5,000. After three washes in TBST, the membranes were
incubated for 20 min in TBST containing goat antirabbit
IgG-peroxidase at a dilution of 1:12,000 and washed in
TBST. Finally, antibody binding was visualized on X-ray
film by using the ECL method (Amersham).
Determination of Xylanase Activity
Plates for the xylanase plate assay contained 0.1% of xylan
Remazol Brilliant Blue (Sigma) in SD minimal medium to
which the required amino acids had been added. Strains
containing the different constructions were inoculated on
the plates, grown for 48 h at 28jC, and the xylanase activity
was detected by the presence of a transparent halo around
the growth. The quantification of the xylanase activity was
done by measuring the amount of reducing sugars, xylose
equivalents, released from birch wood xylan (Sigma), by the
method of Somogyi-Nelson (Spiro, 1966). Samples of
growth medium or cell walls were incubated for 10 min at
50jC in 50 mM Tris-HCl buffer pH 7containing 0.5% of
birch wood xylan. The reaction was stopped by cooling on
ice for 5 min and the determination of reducing sugars was
carried out by the method of Somogyi-Nelson, measuring
the resulting color at 520 nm. One unit of xylanase activity
is defined as the amount of enzyme that releases 1 Amol of
reducing sugar equivalent in 1 min under the assay
conditions described.
RESULTS
PIR4/xynA Gene Fusion Strategies and Expression
in S. cerevisiae
A total of five different gene fusion strategies were at-
tempted with the aim of testing the viability of using Pir4
as a fusion partner for the targeting of xylanase A to the
cell wall, and also to determine the different regions in
Pir4 that are important for its linkage to the cell wall
structure. All four PIR-CWPs share the presence of a sig-
nal peptide and that of a propeptide (Subunit I) that is
processed at the Golgi by the Kex2p protease. The mature
protein (Subunit II) includes a 19 amino acid repetitive do-
main and a very conserved carboxy-terminus that contains
four cysteine residues at fixed positions, which, considering
the extractability of some PIR-CWPs by reducing agents,
should be responsible for cell wall retention.
The structure of the PIR4, as outlined above, and that of
the xynA genes is shown in Figure 1, together with a
schematic representation of the five different fusion
strategies used. The first three (C1–C3) consisted of
inserting all the coding sequence of the xynA gene, minus
the 5V fragment coding the leader peptide, in different
naturally occurring restriction sites of the coding sequence
of PIR4. For this, the xynA sequence was amplified using
plasmid pXA3V1 (Gallardo et al., 2004) as template and
oligonucleotides which included in their 5V ends restriction
sites compatible with the NcoI, BglII, or SalI sites in PIR4,
and which had been designed to fit in-frame in the
corresponding sites in the ORF of PIR4.
Constructions C4 and C5 (Fig. 1) involved the substi-
tution of fragments of PIR4 by the coding sequence of the
xynA gene. In the case of the C4 construction, the xynA
coding sequence was subcloned in the BglII–SalI sites of
Figure 1. Schematic representation of the xynA and PIR4 genes together
with the different PIR4-xynA gene fusions. SP, signal peptide; SI, subunit I;
PM, Pir motive; SII, subunit II; LP, leader peptide.
ANDRÉS ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE
PIR4, with the loss of the carboxy-terminal fragment of
Subunit II of PIR4 that contains three of the four very
conserved cysteine residues that are expected to be
responsible for cell wall retention. Finally, in C5 the xynA
coding sequence was inserted between the NcoI–SalI
restriction sites of PIR4, to give a construction consisting
in the signal peptide of PIR4 followed by the xynA coding
sequence, with the loss of almost the complete coding
sequence of Subunits I and II of PIR4 (Fig. 1).
The five different constructions, based in YEplac112,
were then transformed in the wildtype BY4741 and the
glycosylation-deficient strain mnn9 (Hernandez et al.,
1989) of S. cerevisiae and the resulting recombinant strains
were tested for xylanase activity in plate assays using
Remazol Brilliant Blue xylan as substrate. The results of
this assay are shown in Figure 2. As can be deduced from
the halos around the different strains, constructions C1–C4
confer xylanase activity to the strains harboring them, in
some cases (C4), as intense as that of the positive control,
consisting of a recombinant E. coli strain harboring pXA3V1
(Gallardo et al., 2004).
Study of the Localization of the Recombinant
Pir4-XynA Fusion Proteins by Western Immunoblot
To find out if the Pir4-XynA fusion proteins were being
correctly targeted to the cell wall, and if, as is the case with
Pir4, they could be extracted by reducing agents, h-
mercaptoethanol extracts from purified cell walls of the
different strains and concentrated samples of growth me-
dium were probed by Western immunoblot using an anti-
body that reacts with Pir-CWPs of S. cerevisiae (Moukadiri
et al., 1999). The results (Fig. 3A) show that, at least in
the h-mercaptoethanol extracts from purified cell walls of
the strains transformed with constructions C2 and C3, it
was possible to detect specific bands reactive with the anti-
body and with sizes compatible with those of the ex-
pected fusion proteins. In the case of the wildtype BY4741
strain harboring the C3 construction, the size of the spe-
cific reactive polypeptide is of 58 kDa, which matches the
expected size of 36 kDa for Pir4 plus f20 kDa of the
xylanase portion. In the same strain transformed with C2,
two main polypeptides of 52 and f100 kDa could be de-
tected. A possible interpretation of this 100 kDa polypep-
tide would be that it corresponds to a dimer of the 52 kDa
one, still attached through disulfide bridges despite the
SDS-PAGE procedure. No specific polypeptides could
be detected in the extracts of strains transformed with C1,
C4, and C5. In C1 and C5 this could be explained by the fact
that the resulting fusions may not be recognized by the
antibody, C5 because there is almost nothing of Pir4 itself
left, and C1 because it involves subunit I, which is not rec-
ognized by the antibody. Moreover, in C4 and C5 the four
cysteine region of Pir4, probably responsible for cell wall
retention, is not present and, accordingly, the fusions
resulting from these constructions were not expected to be
targeted to the cell wall.
693
Figure 2. Xylanase plate assay of the different strains harboring constructions C1–C5; halos around the streaks represent degradation of the substrate
(Remazol Brilliant Blue Xylan). Strains based on BY4741 (A), and mnn9 (B). Numbers 1–5 represent the strains harboring constructions C1–C5. Number 6
corresponds to a positive control consisting in an E. coli strain harboring plasmid pXA3V1. Number 7 corresponds to the parental strains BY4741 (A) or
mnn9 (B).

To complete the above results, the presence of Pir4-
XynA fusions was also probed in the growth medium of the
strains harboring the different constructions. Only in the
case of the strain transformed with C4 was it possible to
detect the presence of a series of polypeptides that were
specific to this strain using the Pir antibody. A total of three
bands were detected, of 50, 45, and 40 kDa, the 50 kDa one
probably representing the full size fusion protein, and the
other two, partial degradation products (Fig. 3B). As
mentioned before, the presence of the fusion protein
derived from C4 in the growth medium correlates with
the absence from the resulting fusion protein of the region
of Pir4 that is responsible for cell wall retention. Finally,
no trace of the fusion protein derived from C5 could be
detected. This could be explained by the fact that, as is
the case in C1, the region of Pir4 that is recognized by the
antibody is not included in the resulting fusion protein;
however, it is also important to note that the strain
harboring C5 was the only one that did not exhibit
xylanase activity in the plate assay.
The results obtained with the mnn9-based strains
(Fig. 4A,B) were basically similar to those of the
BY4741-based strains. Specific Pir4-xynA bands of the
expected size were detected in the h-mercaptoethanol
extracts of the mnn9 strains transformed with constructions
C2 and C3 (Fig. 4A). Two Pir4-XynA bands were detected
in each of these strains, probably corresponding to the
Kex2-processed and unprocessed forms of the fusion
protein, as is the case with the native Pir4 in the mnn9
strain (Moukadiri et al., 1999). Finally, the results obtained
with the growth medium showed the presence of specific
Pir4-XynA bands in the mnn9 strain transformed with

Figure 3. Immunoblot localization of the different recombinant fusion-proteins derived from constructions C1–C5 (lanes 2–6) in the wildtype strain
BY4741 of S. cerevisiae using an antibody that reacts with the Pir4 protein. A: h-Mercaptoethanol extracts from purified cell walls. B: Growth medium.
Lane 1 corresponds to the untransformed BY4741 strain of S. cerevisiae.

694 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 89, NO. 6, MARCH 20, 2005
Figure 4. Immunoblot localization of the different recombinant fusion-proteins derived from constructions C1–C5 (lanes 2–6) in the mnn9 glycosylation-
deficient strain of S. cerevisiae using an antibody that reacts with the Pir4 protein. A: h-Mercaptoethanol extracts from purified cell walls. B: Growth
medium. Lane 1 corresponds to the untransformed mnn9 strain of S. cerevisiae.

construction C4 only (Fig. 4B), with sizes very similar to
those found in the wildtype BY4741 strain transformed
with the same construction.
Detection of Xylanase Activity Associated With Cell
Wall or Secreted to the Growth Medium
To confirm the above results and, at the same time, to test
and quantify functionality of the fusion proteins expressed
in the strains transformed with constructions C2, C3, and
C4, xylanase activity was determined in purified cell walls
and cell-free spent culture medium of 24-h cultures of these
strains. The results are shown in Table II. Xylanase activity
associated with the cell walls was detected for both the
wildtype BY4741 and mnn9 strains transformed with
constructions C2, C3, and C4, but not in the cell walls of
the untransformed strains. The detection of xylanase
activity associated with the cell walls in the strains
transformed with construction C4 shows that some fusion
protein was retained at the cell wall, although it could not
be detected by Western blot. However, the level of cell
wall-associated xylanase activity was lower than in the
strains harboring constructions C2 and C3, and most of the
total xylanase activity was detected in the growth medium
(88% of the culture’s total), while no xylanase activity
could be detected in the growth medium of strain BY4741
transformed with either construction C2 or C3. The results
for the transformed strains based on mnn9 confirm that
most of the activity expressed by the strain harboring
construction C4 is secreted to the growth medium;
however, unlike the strains based on BY4741, the mnn9
strains harboring constructions C2 and C3 leak xylanase
activity to the growth medium (Table II). This could be
accounted for by the fact that Pir4 is partly secreted to the
growth medium in the mnn9 strain (Moukadiri and Zueco,
2001), a fate that could presumably be followed by the
Pir4-xylanase fusion proteins derived from constructions
C2 and C4. As a whole, the distribution of the enzymatic
activities matches that of the fusion proteins as determined
by Western blot and specific antibody detection; however,
in some cases no fusion protein could be detected in
samples containing detectable enzymatic activity levels.

Table II. Xylanase activity as determined in cell walls and growth medium of strains BY4741 and
mnn9 of S. cerevisiae, untransformed or harboring constructions C2, C3, or C4.

Cell wall associated activity Activity in growth medium

(Units/l % of culture (Units/l % of culture

(Units/g of culture activity of culture in acitivity in growth
Strain cell walls) in cell walls) in cell walls growth medium) medium

BY4741 0 0 0 0 0
C2-BY4741 1.8 5.76 100 0 0
C3-BY4741 1.5 4.8 100 0 0
C4-BY4741 0.45 1.1 12 8 88
mnn9 0 0 0 0 0
C2-mnn9 0.93 5.95 75 2 25
C3-mnn9 1.17 7.5 45 10 55
C4-mnn9 0.35 2.2 14 14 86

The mean of three experiments is presented.

ANDRÉS ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE 695

DISCUSSION
In a previous report (Moukadiri et al., 1999), we have
shown the use of Pir4, a disulphide bound cell wall protein
of S. cerevisiae, for the targeting of the IgG binding domain
of staphylococcal protein A to the cell wall. Our aim in the
present work was to explore the viability of using Pir4 as a
partner for the targeting of functional enzymes to the yeast
cell wall. For this, xylanase A of Bacillus sp. BP-7 was
used (Gallardo et al., 2004). Of the five different PIR4/
xynA gene fusion constructions tested (C1–C5), four
exhibited xylanase activity in plate assays, and in three of
these the fusion protein could be detected using an antibody
that recognizes the Pir4 moiety. C2 involves the insertion
of the xynA fragment in the region of PIR4 that codes
subunit II, between the 19 amino acids repetitive domain
and the carboxy-terminal region that contains the four
conserved cysteine residues, while in C3, the insertion of
xynA is made just two amino acids before the carboxy-
terminal end of Pir4. In both cases the resulting fusion
proteins are correctly targeted to the cell wall, from where
they can be extracted by reducing agents, and confer
xylanase activity to the cells. However, the sizes of the
respective fusion proteins, as detected by immunoblot
analysis, are slightly different. In the case of C3, the band
detected is relatively well defined and has a size close to
the expected, while in C2, two bands are detected, not very
well defined, and with average sizes of 50 and 100 kDa. A
possible interpretation for this difference could be that in
C3 the insertion would not affect the disulphide formation
in the folding of Pir4, while in C2, because of the insertion
being in the central part of Pir4, it would affect it and even
induce stronger dimer formation, the 100 kDa form being
representative of this. Accordingly, insertions in the SalI
restriction site of PIR4 (C3), which are equivalent to a
carboxy-terminal fusion, are most likely to be correctly
folded and to retain activity, besides being correctly
targeted to the cell wall.
In the case of the mnn9 strain transformed with
construction C2, no dimer form was detected; however,
both in C2 and C3 a double band of the approximate
expected size was detected. Since Pir4 also appears as a
double band in the mnn9 strain, corresponding to the
unprocessed and Kex2-processed forms (Moukadiri et al.,
1999), it is reasonable to assume that the double bands
derived from the C2 and C3 constructions in this strain
correspond also to the unprocessed and Kex2-processed
forms of the fusion proteins.
Different from C2 and C3, the fusion protein derived
from C4 could only be detected in the growth medium, both
in the BY4741 and mnn9 strains, in the form of three
polypeptides of 50, 45, and 40 kDa, probably correspond-
ing to the full-size fusion protein and partial degradation
products. In this case, the construction involved the
substitution of the region containing three of the four
conserved cysteine residues of Pir4 by XynA and, as could
be expected, the fusion protein is no longer retained in the
696 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 89, NO. 6, MARCH 20, 2005
cell wall. Also, the fact that the fusion protein is secreted
would explain the larger halo around the strains harboring
construction C4 in the xylanase activity plate assay. Two
conclusions can be drawn from this result: first, that Pir4
can be used as a carrier for the secretion of heterologous
proteins, in a similar fashion to the a-factor leader
(Romanos et al., 1992) or to Pir2/Hsp150 (Simonen et al.,
1994; Simonen et al., 1996), just by removing the cell wall
retention domain; and second, that the very conserved
carboxy-terminal domain in Pir4, including four cysteine
residues, is indeed responsible for the disulphide cell wall
attachment of Pir4, notwithstanding the fact that Pir4 may
also, to some extent, be linked to the h-1,3-glucan of the
cell wall through an alkali-sensitive linkage that involves
the Pir repetitive domain. Furthermore, Simonen et al.
(1996) suggested that the repetitive domain in Pir2/Hsp150
may allow productive folding of the heterologous protein
fused after it. Since this 19 amino acids domain is present
11 times in Pir2/Hsp150, and only once in Pir4, we can
conclude that the single copy of this domain is enough to
perform this role, at least for the case studied.
The results from the quantification of the xylanase
activity associated with cell walls or secreted to the growth
medium shows that activity is mainly associated with the
cell walls in the strains harboring constructions C2 and C3,
and that xylanase activity of BY4741-based strains is
higher than that of those based in the mnn9 strain, probably
because, in this strain, part of Pir4 is released to the growth
medium (Moukadiri and Zueco, 2001). This is confirmed
by the presence of xylanase activity in the growth medium
of the mnn9 strain harboring constructions C2 and C3.
Finally, no fusion protein derived from C5 could be
detected. This could be easily explained by the fact that the
fusion protein does not include subunit II of Pir4, and it is
not recognized by the antibody used, as is the case with the
fusion protein derived from C1. However, contrary to the
case of C1, no xylanase activity was detected in the plate
assay of the strain harboring C5. This result matches that of
Simonen et al. (1994) in Pir2/Hsp150, which found that a
Pir2/h-lactamase fusion protein was retained at the
endoplasmic reticulum and lacked activity when Subunit
II of Pir2/Hsp150 was not part of the fusion.
In summary, we have developed a Pir4-based system that
allows selective targeting of heterologous proteins to the
cell wall or the growth medium. This system may be of
general application and, at least in the example studied,
leads to cell wall immobilization or to secretion to the
growth medium of an active enzyme.
References
Abe H, Shimma Y, Jigami Y. 2003. In vitro oligosaccharide synthesis
using intact cells that display glycosyltransferases at the cell surface
through cell wall anchored protein Pir. Gycobiology 13:87–95.
Abe H, Ohba M, Shimma Y, Jigami Y. 2004. Yeast cells harboring human
alpha-1,3-fucosyltransferase at cell surface engineered using Pir, a cell
wall anchored protein. FEMS Yeast Res 4:417–425.
Andrés I, Zueco J, Parascandola P. 2003. Immobilization of Saccha-
romyces cerevisiae cells to protein G-Sepharose by cell wall
engineering. J Mol Microbiol Biotechnol 5:161–166.
Beauchemin KA, Rode LM, Sewalt VJH. 1995. Fibrolytic enzymes
increase fiber digestibility and growth rate of steers fed dry forages.
Can J Anim Sci 75:641–644.
Boder ET, Wittrup KD. 1997. Yeast surface display for screening
combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol 15:553–557.
Burnette WN. 1981. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins
from sodium dodecyl-sulfate-polyacrylamide gels to unmodified
nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radio-
iodinated protein A. Anal Biochem 112:195–203.
Gallardo O, Diaz P, Pastor FIJ. 2004. Cloning and characterization of
Xylanase A from the strain Bacillus sp. BP-7. Comparison to alka-
line pI-low molecular weight xylanases of family 11. Curr Microbiol
48:276–279.
Ganga MA, Piñaga F, Vallés S, Ramón D, Querol A. 1999. Aroma im-
proving in microvinification processes by the use of a recombinant
wine yeast strain expressing the Aspergillus nidulans xlnA gene. Int
J Food Microbiol 47:171–178.
Gietz RD, Sugino A. 1988. New yeast-Escherichia coli shuttle vector
constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base
pair restriction sites. Gene 74:527–534.
Hernandez LM, Ballou L, Alvarado E, Gillece-Castro BL, Burlingame AL,
Ballou CE. 1989. A new Saccharomyces cerevisiae mnn mutant N-
linked oligosaccharide structure. J Biol Chem 246:11846–11856.
Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. 1983. Transformation of intact
yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol 153:163–168.
Jeffries TW. 1983. Utilization of xylose by bacteria, yeast and fungi. Adv
Biochem Eng 27:1–32.
Kieke MC, Cho BK, Boder ET, Kranz DM, Wittrup KD. 1997. Isolation of
anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. Prot Eng
10:1303–1310.
Klis FM. 1994. Review: cell wall assembly in yeast. YEAST 10:851–869.
Klis FM, Mol P, Hellingwerf K, Brul S. 2002. Dynamics of cell wall
structure in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Micobiol Rev 738:
1–18.
La Grange DC, Pretorius IS, Claeyssens M, Van Zyl WH. 2001. Degradation
of xylan to d-xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae
coexpressing the Aspergillus niger h-xylosidase (xlnD) and the
Trichoderma reesei xylanase II (xyn2) genes. Appl Environ Microbiol
67:5512–5519.
Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the head
assembly of bacteriophage T4. Nature 227:680–685.
Li XL, Ljungdahl LG. 1996. Expression of Aureobasidium pullulans xynA
in, and secretion of the xylanase from, Saccharomyces cerevisiae.
Appl Environ Microbiol 62:209–213.
Luonteri E, Tenkanen M, Siika-Aho M, Buchert J, Viikari L. 1996. a-
Arabinosidases of Aspergillus terreus and their potentials in pulp and
paper application. In: Srebotnik E, Messner K, editors. Biotechnology
in the pulp and paper industry. Vienna: Facultas-Universitätsverlag.
p 119–122.
Maat J, Roza M, Verbakel J, Stam H, Santos da Silva MJ, Bosse M,
Egmond MR, Hagemans MLD, Gorcom RFMV, Hessing JGM, Van
der Hondel CAMJJ, Rotterdam CV. 1992. Xylanases and their appli-
cation in bakery. In: Visser J, Beldman G, Kusters-Van Someren MA,
Voragen AGJ, editors. Xylan and xylanases. Amsterdam: Elsevier
Science. p 349–360.
Matsumoto T, Fukuda H, Ueda M, Tanaka A, Kondo A. 2002. Con-
struction of yeast strains with high cell surface lipase activity by using
novel display system based on the Flo1p flocculation functional
domain. Appl Environ Microbiol 68:4517–4522.
Moukadiri I, Zueco J. 2001. Evidence for the attachment of Hsp150/Pir2 to
the cell wall of Saccharomyces cerevisiae through disulfide bridges.
FEMS Yeast Res 1:241–245.
Moukadiri I, Jaafar L, Zueco J. 1999. Identification of two mannoproteins
released from cell walls of a Saccharomyces cerevisiae mnn1 mnn9
double mutant by reducing agents. J Bacteriol 181:4741–4745.
ANDRÉS ET AL.: PIR-4 BASED EXPRESSION OF A XYLANASE
Mrsa V, Seidl T, Gentzsch M, Tanner W. 1997. Specific labelling of cell
wall proteins by biotinylation. Identification of four covalently linked
O-mannosylated proteins of Saccharomyces cerevisiae. YEAST 13:
1145–1154.
Murai T, Ueda M, Yamamura M, Atomi H, Shibasaki Y, Kamasawa N,
Osumi M, Amachi T, Tanaka A. 1997a. Construction of a starch-
utilizing yeast by cell surface engineering. Appl Environ Microbiol
63:1362–1366.
Murai T, Ueda M, Atomi H, Shibasaki Y, Kamasawa N, Osumi M,
Kawaguchi T, Arai M, Tanaka A. 1997b. Genetic immobilization of
cellulase on the cell surface of Saccharomyces cerevisiae. Appl
Microbiol Biotechnol 48:499–503.
Murai T, Ueda M, Kawaguchi T, Arai M, Tanaka A. 1998. Assimilation of
cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing h-
glucosidase and carboxymethylcellulase from Aspergillus aculeatus.
Appl Microbiol Biotechnol 64:4857–4861.
Murai T, Ueda M, Shibasaki Y, Kamasawa N, Osumi M, Imanaka T,
Tanaka A. 1999. Development of an arming yeast strain for efficient
utilization of starch by co-display of sequential amylolytic enzymes on
the cell surface. Appl Microbiol Biotechnol 51:65–70.
Pérez-Gonzaléz JA, De Graaf LH, Visser J, Ramón D. 1996. Molecular
cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of two
Aspergillus nidulans Xylanase genes. Appl Environ Microbiol 62:
2179–2182.
Romanos MA, Scorer CA, Clare JJ. 1992. Foreign gene expression in
yeast: a review. YEAST 8:423–488.
Russo P, Kalkkinen N, Sareneva H, Paakkola J, Makarow M. 1992. A heat
shock gene from Saccharomyces cerevisiae encoding a secretory
glycoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A 89:3671–3675.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Sato N, Matsumoto T, Ueda M, Tanaka A, Fukuda H, Kondo A. 2002.
Long anchor using Flo1 protein enhances reactivity of cell surface-
displayed glucoamylase to polymer substrates. Appl Microbiol
Biotechnol 60:469–474.
Schreuder MP, Brekelmans S, Van den Ende H, Klis FM. 1993. Targeting
of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae.
YEAST 9:399–409.
Schreuder MP, Mooren ATA, Toschka HY, Verrips CT, Klis FM. 1996.
Immobilizing enzymes on the surface of yeast cells. Trends Bio-
technol 14:115–120.
Simonen M, Jämsä E, Makarow M. 1994. The role of the carrier protein
and disulfide formation in the folding of h-lactamase fusion
proteins in the endoplasmic reticulum of yeast. J Biol Chem 269:
13887–13892.
Simonen M, Vihinen H, Jämsä E, Arumäe U, Kalkkinen N, Makarow M.
1996. The hsp150
-carrier confers secretion competence to the rat
nerve growth factor receptor ectodomain in Saccharomyces cerevi-
siae. YEAST 12:457–466.
Spiro RG. 1966. The Nelson-Somogyi copper reduction method. Analysis
of sugars found in glycoprotein. Methods Enzymol 8:3–26.
Toh-e A, Yasunaga S, Nisogi H, Tanaka K, Oguchi T, Matsui Y. 1993.
Three yeast genes, PIR1, PIR2 and PIR3, containing internal tandem
repeats are related to each other, and PIR1 and PIR2 are required for
tolerance to heat shock. YEAST 9:481–494.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure
and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76:4350–4354.
Van der Vaart JM, te Biesebeke R, Chapman JW, Toschka HY, Klis FM,
Verrips T. 1997. Comparison of cell wall proteins of Saccharomyces
cerevisiae as anchors for cell surface expression of heterologous
proteins. Appl Environ Microbiol 63:615–620.
Washida M, Takahashi S, Ueda M, Tanaka A. 2001. Spacer-mediated
display of active lipase on the yeast cell surface. Appl Microbiol
Biotechnol 56:681–686.
Wittrup KD. 2001. Protein engineering by cell-surface display. Curr Opin
Biotechnol 12:395–399.
697
 Biocatalysis and Biotransformation, March
August 2007; 25(2
4): 157
162
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ORIGINAL ARTICLE

Cloning and production of Xylanase B from Paenibacillus

barcinonensis in Bacillus subtilis hosts

OSCAR GALLARDO, PILAR DIAZ, & F. I. JAVIER PASTOR

Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Barcelona, Spain

Abstract
Xylanase B from Paenibacillus barcinonensis was cloned in shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis ,
and expressed in Bacillus hosts. Several recombinant strains were constructed, among which B. subtilis MW15/pRBSPOX20
showed the highest production. This recombinant strain consists of a protease double mutant host containing
P. barcinonensis xynB gene under the control of a phage SPO2 strong promoter. Maximum production was found
when the strain was cultured in nutrient broth supplemented with xylans. Analysis of xylanase B location in B. subtilis
MW15/pRBSPOX20 showed that the enzyme remained cell-associated in young cultures, consistent with its intracellular
location in its original host, P. barcinonensis, and the lack of a signal peptide. However, when cultures reached the stationary
phase, xylanase B was released to the external medium as a result of cell lysis. The amount of enzyme located in the
supernatants of old cultures could account for 50% of total xylanase activity. Analysis by SDS
PAGE showed that xylanase
B is an abundant protein found in the culture medium in late stationary phase cultures.

Keywords: Xylanase, production, expression, Bacillus

Introduction feed industries (Bedford & Classen 1992; Monfort

Xylan is a major structural component of plant cell
walls and, after cellulose, is the second most abun-
dant renewable polysaccharide in nature (Collins
et al. 2005). Biodegradation of xylan is a complex
process that requires the co-ordinate action of several
enzymes, among which xylanases (1,4-b-D-xylan
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), cleaving internal lin-
kages on the b-1,4-xylose backbone, play a key role
(Gilkes et al. 1991; Henrissat & Bairoch 1996). The
complex chemical nature and heterogeneity of xylan
can account for the multiplicity of xylanases pro-
duced by micro-organisms (Kulkarni et al. 1999).
Xylanases have important applications in industry
due to their enormous potential to modify and
transform plant-derived biomass, which is used in
a wide variety of industrial processes. One of the
most successful biotechnological applications of
these enzymes is in pulp bleaching, where xylanase
pretreatment results in important economic and
environmental advantages over the non-enzymatic
process (Viikari et al. 1994; Bajpai 2004). Xylanases
have also important applications in food and animal
et al. 1996). The synthesis of new xylosides is a
promising application, where xylanases with trans-
glycosidase activity can be of special interest (Jiang
et al. 2004).
Paenibacillus barcinonensis is a recently identified
new species that produces a complex set of enzymes
for xylan degradation (Blanco et al. 1995, 1999;
Sánchez et al. 2005). One of these enzymes, xylanase
B, has previously been cloned and characterized
(Blanco et al. 1996). In contrast with known
xylanases, which are secreted to the extracellular
medium to allow contact and cleavage of highly
polymerized xylans, xylanase B is a cytoplasmic
enzyme that may represent a new type of enzyme
involved in xylan degradation (Gallardo et al. 2003).
Xylanase B shows transglycosidase activity on oligo-
saccharides, suggesting that it has a potential for the
synthesis of new compounds (Blanco et al. 1996). In
this article, we describe the expression of xylanase B
in different microbial hosts as a first step in
constructing recombinant strains able to produce
high amounts of enzyme to be evaluated in biotech-
nological applications.

Correspondence: F. I. J. Pastor, Department de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Avinguda Diagonal 645,
08028 Barcelona, Spain. Tel: 34 93 4034626. Fax: 34 93 4034629. E-mail: fpastor@ub.edu
 158 O. Gallardo et al.
Materials and methods
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Bacterial strains and plasmids
Escherichia coli /pX60 is a recombinant strain con-
taining xynB described previously (Blanco et al.
1996). Bacillus subtilis MB216 (trpC2 thr-5) and
B. subtilis MW15 (his nprR2 nprE18 DaprA3
DeglS102 DbglT bglSRV DxynA CmR) have been
described elsewhere (Lampen et al. 1986; Wolf et al.
1995). Plasmid pN5 is a shuttle vector for E. coli and
B. subtilis that was constructed in this work by
ligation of partially Sau 3A-digested pUC19 and
pC194 plasmids (Horinouchi & Weisblum 1982).
A 1.3 Kb DNA segment of P. barcinonensis, contain-
ing xynB preceded by a region with partial homology
to Bacillus spp promoters, was amplified by PCR
from pX60 and inserted at the Sma I site of pN5.
The resulting plasmid was named pN5X20. Plasmid
pRBSPOX20 contains the xynB structural gene
cloned downstream of the SPO2 promoter of vector
pRBSPO (Gallardo et al. 2003). Strains were
cultured at 308C in nutrient broth, BREC1 (Over-
beeke et al. 1990), MG and MG2 (Hoch 1991).
When necessary, media were supplemented with 1%
oat spelt xylan (Sigma Chemical Co.), 0.2% birch-
wood xylan (Sigma Chemical Co.), or 1% rice straw.
Nucleic acid manipulations
Plasmid DNA was purified by the alkaline lysis
procedure (Sambrook et al. 1989) or through chro-
matography (QIAGen-tip 100 MidiPrep, QIAGen).
PCR amplification was performed using Pfu DNA
Polymerase (Stratagene). Restriction nucleases and
ligase were purchased from Boehringer Mannheim
and used according to the manufacturer’s instruc-
tions. E. coli was transformed as described (Sam-
brook et al. 1989). Protoplasts from B. subtilis were
obtained by lysozyme treatment of cells from mid-log
phase cultures and transformed as described (Chang
& Cohen 1979). The sequence of both strands of
xynB was determined by automated fluorescence
TM
sequencing with an ABI PRISM dye terminator
cycle sequencing ready reaction mix (Perkin-Elmer)
in a 377 Perkin-Elmer DNA sequencer.
Enzyme assays
Cultures from B. subtilis MB216/pN5X20, B. subtilis
MW15/pN5X20, B. subtilis MB216/pRBSPOX20
and B. subtilis MW15/pRBSPOX20 were centri-
fuged and supernatants and pellets separated. To
obtain cell extracts, pelleted cells were washed in
water, resuspended in 100 mM Tris/HCl and dis-
rupted by sonication (four pulses of 2 min). Enz-
yme activity of cell extracts and supernatants was
evaluated. Xylanase activity was assayed by measur-
ing the amount of reducing sugars released from
birchwood xylan using the method of Nelson and
Somogyi (Spiro 1966). The assay mixture contained
0.5% xylan in a final volume of 0.1 mL of 50 mM
acetate buffer pH 5.5. After 15 min incubation at
408C, color development was measured at 520 nm.
One unit of enzymatic activity was defined as the
amount of enzyme that released 1 mmol of reducing
sugar equivalent per minute under the assay condi-
tions described. Xylanase activity in supernatants
from cultures containing glucose or other substances
that could interfere in the determination of reducing
sugars was determined by evaluating the release of
soluble color from Remazol Brilliant Blue xylan
(Sigma Chemical Co.). The assay mixture contained
6 mg mL1 of Remazol Brilliant Blue xylan in a final
volume of 0.5 mL of 50 mM acetate buffer pH 5.5.
The mixture was incubated at 408C for 15 min and 1
mL of absolute ethanol was added. After further
incubation for 30 min at room temperature, samples
were centrifuged at 2 000 g for 3 min and the color
released to the supernatant measured at 595 nm. To
quantify the activity assayed by the Remazol Brilliant
Blue xylan system, xylanase activity of control
samples was determined by the two assay methods
described and a standard plot was obtained.
Gel electrophoresis
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel elec-
trophoresis (SDS
PAGE) was performed in 12%
gels essentially as described by Laemmli (1970).
Results
Cloning of xylanase B in selected strains of Bacillus
subtilis
Xylanase B from P. barcinonensis was previously
identified and characterized from E. coli /pX60, a
recombinant clone containing xynB (Blanco et al.
1996). The enzyme shows high specific activity on
aryl-xylosides, probably as a result of transglycosi-
dase activity, as revealed from the study of its mode
of action on xylooligosaccharides (Blanco et al.
1996). This makes the enzyme a good candidate
for biotechnological applications.
The choice of an appropriate host is usually an
important factor in obtaining high levels of expres-
sion and production of recombinant enzymes.
B. subtilis can be successfully used for the production
of heterologous proteins of other endosporulating
Gram-positive bacteria. To obtain a high level of
production of xylanase B, we cloned xynB in shuttle
vectors for E. coli and B. subtilis. The two shuttle
vectors used, pN5 and pRBSPO, were derived from
 Cloning and production of Xylanase B 159

E. coli plasmids pUC19 or pBR322, respectively, and activity after 3 to 8 days of incubation, and in all
from plasmids pC194 or pUB110, respectively, for cases xylanase production was increased in media
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cloning in B. subtilis (see Materials and methods). In
the case of pN5, xynB was placed under the control
of its own putative promoter, while in the case of
pRBSPO, the xynB structural gene was cloned
downstream of the SPO2 phage promoter contained
in this vector.
The plasmids constructed, pN5X20 and
pRBSPOX20, were selected from E. coli transfor-
mants that showed xylanase activity on plate assays.
These plasmids were subsequently isolated and
introduced in B. subtilis by protoplast transforma-
tion. Two different strains were used as recipient
host: B. subtilis MB216 (with background xylanase
activity) and B. subtilis MW15 (devoid of xylanase
activity). The recombinant strains obtained were
grown in nutrient broth supplemented with the
corresponding antibiotics and xylanase activity in
the culture supernatants was determined (Figure 1).
Recombinant strains containing plasmid pN5X20
did not show a significant increase of xylanase
activity over the non-recombinant parental strains.
However, recombinant strains carrying plasmid
pRBSPOX20 showed notable xylanase activity.
Maximum production was obtained with B. subtilis
MW15/pRBSPOX20, which was selected for further
studies.
Influence of culture media on xylanase production
B. subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown in differ-
ent culture media that were supplemented with
birchwood xylan, oat spelt xylan or rice straw.
Samples were taken at different intervals and xyla-
nase activity in culture supernatants was deter-
mined. All cultures showed maximum xylanase
0.06
Xylanase activity (U/ml)
with xylans or rice straw (Table I). Cultures supple-
mented with these substrates showed a notable
increase in xylanase production when compared to
the non-supplemented cultures, which in some cases
(MG2 and BREC) did not show detectable xylanase
activity. In most cultures, birchwood xylan and rice
straw showed a similar stimulating effect in the
production of xylanase, while cultures supplemented
with oat spelt usually displayed lower xylanase
activity. Maximum xylanase production was ob-
tained when strain B. subtilis MW15/pRBSPOX20
was grown on birchwood xylan supplemented nu-
trient broth. In this medium, 0.23 xylanase activity
units mL1 were detected in supernatants of 3-day-
old cultures.
Cellular location of xylanase B in Bacillus subtilis
Previous analysis of xylanase B showed that it does
not have a signal peptide for secretion outside the
cells, and, accordingly, it is a cytoplasmic enzyme in
its original host, P. barcinonensis (Gallardo et al.
2003). The physiological role of intracellular xylanase
B in xylan degradation is unclear, but it is probably in
the hydrolysis of the oligosaccharides resulting
from xylan degradation by extracellular xylanases,
once they have been transported inside the cells.
In the results shown up to this point, xylanase
activity determinations were performed in culture
supernatants of the recombinant strains constructed.
Detection of activity in these samples indicated that at
least a percentage of the xylanase produced by the
recombinant strains was released to the extracellular
Table I. Production of xylanase by Bacillus subtilis MW15/
pRBSPOX20 cultured in media supplemented with different
polysaccharides.
Polysaccharide Days of Activity
Culture media added culture (U mL 1)

0.05

0.04 Nutrient brotha
4 0.06

Oat spelt xylan 3 0.09
0.03 Rice straw 4 0.20
Birchwood xylan 3 0.23
0.02 MGb
8 0.02
Oat spelt xylan 8 0.16
0.01 Rice straw 8 0.16
MG2b
0.00
0.00 Oat spelt xylan 3 0.09
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Rice straw 8 0.13
Days BREC1b
0.00
Oat spelt xylan 8 0.15
Figure 1. Production of xylanase activity by recombinant strains Rice straw 4 0.07
of Bacillus subtilis carrying xynB . B. subtilis MB216 ('), B. subtilis
a
MW15 (^), B. subtilis MB216/pRBSPOX20 (m), and B. subtilis Xylanase activity was determined by the method of Nelson and
MW15/pRBSPOX20 (k) were grown at 308C in nutrient broth. Somogyi.
b
Samples were collected at different intervals and xylanase activity Activity was determined by the Remazol Brilliant Blue Xylan
in supernatants of cultures was determined. assay.
 160 O. Gallardo et al.

medium. To analyze the location of xylanase B in kDa

B. subtilis MW15/pRBSPOX20, the strain was cul-
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tured in nutrient broth supplemented with birchwood

xylan, samples were taken at different intervals, and
xylanase activity determined in both cell extracts and
culture supernatants (Figure 2). Xylanase activity
116 -
remained cell associated in young cultures, through 97 -
the exponential phase of growth. However, when
cultures reached the stationary phase, a significant
amount of xylanase activity was released to the 66 -
external medium, and in 3-day-old cultures around
50% of total activity was found in the supernatants.
The cellular location of xylanase B in B. subtilis
MW15/pRBSPOX20 was also examined by SDS- 45 -
PAGE. Supernatants from 3-day cultures showed a
prominent 40 kDa protein band, corresponding to
31 -
xylanase B, not found in supernatants from control
B. subtilis cultures (Figure 3). Cell extracts from
B. subtilis MW15/pRBSPOX20 also showed a pro- 21 -
minent band (not shown) with identical mobility to
that found in the supernatants of old cultures,
suggesting the lack of processing of the enzyme found
extracellularly, which was probably released as a
result of cell lysis. 1 2
Figure 3. SDS
PAGE analysis of extracellular fractions from
Discussion Bacillus subtilis MW15/pRBSPOX20. B. subtilis MW15/
pRBSPOX20 and control B. subtilis MW15/pRBSPO were
Xylanase B from P. barcinonensis has several proper- cultured at 308C. Samples were taken after 3 days of incubation,
ties that make it an unusual enzyme among xylanases centrifuged and supernatants were analyzed by SDS
PAGE.
(Blanco et al. 1996; Gallardo et al. 2003). One of the Lane 1, concentrated supernatants from B. subtilis MW15/
properties is transglycosidase activity, which makes pRBSPOX20. Lane 2, concentrated supernatants from B. subtilis
MW15/pRBSPO. The positions of molecular weight markers are
the enzyme a good candidate for biotechnological indicated.
application in the synthesis of new xylosides
with potential use in food, pharmaceutical and xylanase B, we constructed several recombinant
detergency industries (Jiang et al. 2004). Biotechno- strains in which xynB was cloned in different
logical evaluation of enzymes usually requires the
plasmid vectors and expressed under the control of
availability of high amounts of purified or enriched
different promoters in several host strains. B. subtilis
samples. As a first stage in the production of
is a well known micro-organism successfully used
0.25 1.0
for industrial production of enzymes and proteins
(Harwood 1992; Ferrari et al. 1993; Wong 1995).
Xylanase activity (U/ml)

0.20 0.8 We selected it as a host for the heterologous

O.D. 600nm

production of xylanase B from P. barcinonensis. One

0.15 0.6
of the strains used, B. subtilis MB216, was selected
0.10 0.4 because of its efficiency in producing heterologous
proteins from other bacilli (Lampen et al. 1986),
0.05 0.2
whereas the second strain, B. subtilis MW15, is a
double mutant deficient in neutral and alkaline
0 24 48 72 protease activity, which additionally is devoid of
Hours background xylanase activity (Wolf et al. 1995). In
Figure 2. Cellular location of xylanase activity in Bacillus subtilis the experiments performed in this work, the strain
MW15/pRBSPOX20. B. subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown B. subtilis MW15 showed the highest production of
at 308C in nutrient broth supplemented with birchwood xylan, recombinant xylanase B, in agreement with previous
samples were taken at different intervals of incubation, fraction-
ated into cell extracts and supernatants, and xylanase activity
results showing the effectiveness of protease-
determined. Culture O.D.600nm ('), xylanase activity in cell deficient mutants of B. subtilis for the expression of
extracts (m), xylanase activity in supernatants (I). enzymes and proteins (Wu et al. 1991).

Regarding the plasmids constructed, plasmid
pN5X20 did not give rise to the production of
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detectable xylanase activity by the B. subtilis strains
that contained it. This may be due to the absence of
Bacillus promoters in the shuttle vector used, pN5.
However, the DNA insert of pN5X20 contained
both the structural gene xynB plus a 121 bp DNA
upstream fragment that included a region with
partial sequence similar to those recognized by the
sA factor of Bacillus RNA polymerase. This putative
promoter sequence included in pN5X20 seems not
to be functional in the B. subtilis hosts used in this
work, although promoters from Bacillus and related
genera are usually active in B. subtilis hosts, and can
give rise to high levels of production (Sumitomo
et al. 1995). The results obtained here suggest that
the 121 bp region upstream xynB structural gene
may not be a functional promoter in its natural host
P. barcinonensis. Plasmid pRBSPOX20, however,
expressed high xylanase activity in the two host
strains assayed, probably as a result of the good
performance of the SPO2 promoter located up-
stream of xynB. Several studies have shown that
the SPO2 promoter can give rise to high expression
of heterologous enzymes (Schoner et al. 1983;
Bolhius et al. 1999). High levels of production of
recombinant proteins in B. subtilis have also been
reported using promoters, such as SPO1 phage
(Osbourne & Craig 1986) and the a-amylase pro-
moter from B. amyloliquefaciens (Palva et al. 1981;
Inoue et al. 2002, Yamamoto et al. 2005).
Among the several culture media assayed, max-
imum xylanase production was found when B.
subtilis MW15/pRBSPOX20 was grown in nutrient
broth. The reported increase of production in media
with high ammonium concentration (MG, MG2 and
BRECI), that suppress expression of residual pro-
tease in protease deficient strains (Overbeeke et al.
1990) seems not to apply in our experiments. In all
media tested, xylan supplementation enhanced xyla-
nase production, probably as a result of a higher
growth of the strains in these media, as confirmed by
the determination of cell protein contents of samples.
Xylanase B was mostly located in the cytoplasm of
B. subtilis hosts in accordance with the intracellular
location of the enzyme in its original host
P. barcinonensis , and the lack of a signal peptide
(Gallardo et al. 2003). This is in agreement with the
need for a signal peptide for enzyme export to the
extracellular medium in B. subtilis (Nagarajan
1993). Although alternative, signal peptide-indepen-
dent, secretion pathways have been described in
Gram-negative bacteria (Binet et al. 1997), similar
pathways for protein secretion in B. subtilis have not
been reported to date. Our results show that when
cultures of B. subtilis MW15/pRBSPOX20 pro-
Cloning and production of Xylanase B 161
gressed into the stationary phase, a significant
amount of xylanase B was released to the media.
Most probably this is non-specific release, resulting
from cell lysis of old cultures, as the activity of the
cytoplasmic enzyme malate dehydrogenase, assayed
in parallel, was also released to the medium in these
cultures (data not shown). We have obtained a high
level of expression and production of recombinant
xylanase B in B. subtilis. At present, new construc-
tions using alternative promoters and Bacillus host
strains are being prepared to obtain higher levels of
production of the enzyme. This should facilitate
biotechnological evaluation of xylanase B, an en-
zyme of unique and distinctive properties among
xylanases.
Acknowledgements
We thank Monika Wolf for her gift of bacterial strain
Bacillus subtilis MW15. We also thank the Serveis
Cientı́fico-Tècnics of the University of Barcelona for
their support in nucleotide sequencing, and Margar-
ita Soriano for technical aid in the construction of
pRBSPOX20. This work was partially supported by
the Spanish Ministry of Education and Science,
project ref. CTQ2004-07560-CO2-02.
References
Bajpai P. 2004. Biological bleaching of chemical pulps. Crit Rev
Biotechnol 24:1
58.
Bedford MR, Classen HL. 1992. The influence of dietary
xylanase on intestinal viscosity and molecular weight distribu-
tion of carbohydrates in rye-fed broiler chicks. In: Visser J,
Beldman G, Kusters-van Someren MA, Voragen AGJ, editors.
Xylans and xylanases. Amsterdam: Elsevier. pp 361
370.
Binet R, Létoffé S, Ghigo JM, Delepelaire P, Wandersman C.
1997. Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC
exporters
a review. Gene 192:7
11.
Blanco A, Vidal T, Colom JF, Pastor FIJ. 1995. Purification and
properties of xylanase A from alkali-tolerant Bacillus sp. strain
BP-23. Appl Environ Microbiol 61:4468
4470.
Blanco A, Dı́az P, Martı́nez J, López O, Soler C, Pastor FIJ. 1996.
Cloning of a Bacillus sp. BP-23 gene encoding a xylanase with
high activity against aryl-xylosides. FEMS Microbiol Lett
137:285
290.
Blanco A, Dı́az P, Zueco J, Parascandola P, Pastor FIJ. 1999. A
multidomain xylanase from a Bacillus sp. with a region
homologous to thermostabilizing domains of thermophilic
enzymes. Microbiology 145:2163
2170.
Bolhuis A, Tjalsma H, Smith HE, De Jong A, Meima R, Venema
G, Bron S, Van Dijl JM. 1999. Evaluation of bottlenecks in the
late stages of protein secretion in Bacillus subtilis . Appl Environ
Microbiol 65:2934
2941.
Chang S, Cohen SN. 1979. High frequency transformation of
Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA. Mol Gen Genet
168:111
115.
Collins T, Gerday C, Feller G. 2005. Xylanases, xylanase families
and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol Rev 29:3
23.
Ferrari E, Jarnagin AS, Schmidt BF. 1993. Commercial produc-
tion of extracellular enzymes. In: Sonenshein AL, Hoch JA,
Losick R, editors. Bacillus subtilis and other Gram-positive
 162 O. Gallardo et al.
bacteria. Biochemistry, physiology and molecular genetics.
Washington, DC: American Society for Microbiology. pp 917

Downloaded By: [Uab-02/Science Lib] At: 13:35 16 October 2007
937.
Gallardo O, Diaz P, Pastor FIJ. 2003. Characterization of a
Paenibacillus cell-associated xylanase with high activity on aryl-
xylosides: A new subclass of family 10 xylanases. Appl
Microbiol Biotechnol 61:226
233.
Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC Jr, Warren RAJ.
1991. Domains in microbial b-1,4-glycanases: Sequence con-
servation, function, and enzyme families. Microbiol Rev
55:303
315.
Harwood CR. 1992. Bacillus subtilis and its relatives: Molecular,
biological and industrial workhorses. Trends Biotechnol
10:247
256.
Henrissat B, Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based
classification of glycosyl hydrolases. Biochem J 316:695
696.
Hoch JA. 1991. Genetic analysis in Bacillus subtilis . Method
Enzymol 204:305
320.
Horinouchi S, Weisblum B. 1982. Nucleotide sequence and
functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible
chloramphenicol resistance. J Bacteriol 150:815
825.
Inoue Y, Yasutake N, Oshima Y, Yamamoto Y, Tomita T, Miyoshi
S, Yatake T. 2002. Cloning of the maltose phosphorylase gene
from Bacillus sp strain RK-1 and efficient production of the
cloned gene and the trehalose phosphorylase gene from Bacillus
stearothermophilus SK-1 in Bacillus subtilis . Biosci Biotechnol
Biochem 66:2594
2599.
Jiang Z, Zhu Y, Li L, Yu X, Kusakabe I, Kitaoka M, Hayashi K.
2004. Transglycolysation reaction of xylanase B from the
hyperthermophilic Thermotoga maritima with the ability of
synthesis of tertiary alkyl b-D-lobiosides and xylosides. J
Biotechnol 114:125
134.
Kulkarni N, Shendye A, Rao M. 1999. Molecular and biotech-
nological aspects of xylanases. FEMS Microbiol Rev 23:411

456.
Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680

685.
Lampen JO, Pastor FIJ, Hussain M. 1986. Processing of secreted
proteins and the signal peptidases of bacilli. In: Leive L,
Bonventre PF, Morello JA, Silver SD, Wu HC, editors.
Microbiology 86. Washington, DC: American Society for
Microbiology. p 279
282.
Monfort A, Blasco A, Prieto JA, Sanz P. 1996. Combined
expression of Aspergillus nidulans endoxylanase X24 and
Aspergillus oryzae a-amylase in industrial bakers’s yeasts and
their use in bread making. Appl Environ Microbiol 62:3712

3715.
Nagarajan V. 1993. Protein secretion. In: Sonenshein AL, Hoch
JA, Losick R, editors. Bacillus subtilis and other Gram-positive
bacteria (Biochemistry, physiology, and molecular genetics).
Washington, DC: American Society for Microbiology. p 713

726.
Osbourne MS, Craig RJ. 1986. Activity of two strong promoters
cloned into Bacillus subtilis . J Gen Microbiol 132:565
568.
Overbeeke N, Termorshuizen GHM, Giuseppin MLF, Under-
wood DR, Verrips CT. 1990. Secretion of the a-galactosidase
from Cyamopsis tetragonoloba (Guar) by Bacillus subtilis . Appl
Environ Microbiol 56:1429
1434.
Palva I, Petterson RF, Kalkkinen N, Lehtovaara P, Sarvas M,
Södelund H, Takkinen K, Kääriäinen L. 1981. Nucleotide
sequence of the promoter and the NH2-terminal signal peptide
region of the a-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens .
Gene 15:43
51.
Sánchez MM, Fritze D, Blanco A, Spröer C, Tindall BJ,
Schumann P, Kroppenstedt RM, Diaz P, Pastor FIJ. 2005.
Paenibacillus barcinonensis sp. nov., a xylanase-producing bac-
terium isolated from a rice field in the Ebro River delta. Int J
Syst Evol Microbiol 55:935
939.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A
laboratory manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold
Spring Harbor Laboratory.
Schoner RG, Williams DM, Lovett PS. 1983. Enhanced expres-
sion of mouse dihydrofolate reductase in Bacillus subtilis . Gene
22:47
57.
Spiro RG. 1966. The Nelson-Somogyi copper reduction method.
Analysis of sugars found in glycoprotein. Methods Enzymol
8:3
26.
Sumitomo N, Ozaki K, Hitomi J, Kawaminami S, Kobayashi T,
Kawai S, Ito S. 1995. Application of the upstream region of a
Bacillus endoglucanase gene to high-level expression of foreign
genes in Bacillus subtilis . Biosci Biotech Biochem 59:2172

2175.
Viikari L, Kantelinen A, Sundquist J, Linko M. 1994. Xylanases
in bleaching: From an idea to the industry. FEMS Microbiol
Rev 13:335
350.
Wolf M, Geczi A, Simon O, Borriss R. 1995. Genes encoding
xylan and b-glucan hydrolysing enzymes in Bacillus subtilis :
Characterization, mapping and construction of strains deficient
in lichenase, cellulase and xylanase. Microbiology 141:281

290.
Wu XC, Lee W, Tran L, Wong SL. 1991. Engineering a Bacillus
subtilis expression
secretion system with a strain deficient in six
extracellular proteases. J Bacteriol 173:4952
4958.
Wong SL. 1995. Advances in the use of Bacillus subtilis for the
expression and secretion of heterologous proteins. Curr Opin
Biotech 6:517
522.
Yamamoto T, Mukai K, Maruta K, Watanabe H, Yamashita H,
Nishimoto T, Kubota M, Chaen H, Fukuda S. 2005. Hyper
expression of kojibiose phosphorylase gene and trehalose
phosphorylase gene from Thermoanaerobacter brocki
ATCC35047 in Bacillus subtilis and selaginose synthesis utiliz-
ing two phosphorylases. J Biosci Bioeng 100:343
346.
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 Tesis Doctoral
Óscar Gallardo Román
Barcelona, 2007